Professional Documents
Culture Documents
Laboratorijske vjebe
Student: ______________________
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Sadraj vjebi 1. 2. 3 4 5 6 7 8 9. Identifikacija organskih spojeva-reakcije na funkcionalne grupe............. Kvalitativno odreivanje ugljikohidrata................................................... Polisaharidi............................................................................................... Kvantitativno odreivanje glukoze polarimetrijskom metodom.............. Kvalitativno odreivanje lipida................................................................. Odreivanje saponifikacionog broja......................................................... Kvalitativno odreivanje proteina............................................................. Hidroliza i hromatografija proteina (hromatografija na tankom sloju)..... Enzimi. Odreivanje aktivnosti -amilaze............................................... 3 19 26 30 35 41 44 51 55
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Funkcionalna grupa
Primjer
Ime prema IUPAC -u (trivijalno ime) Eten (etilen) Etin (acetilen) Etanska kiselina (acetatna kiselina; siretna kiselina) Etilmetanoat (etilformijat) Etanamid (acetamid) Metanal (formaldehid)
Upotreba meuprodukt; regulator rasta biljaka meuprodukt; sredstvo za zavarivanje meuprodukt; kisela komponenta sireta Aromatini dodatak u limunadi Otapalo; aditiv za plastine mase i za denaturaciju alkohola Prisutan u dimu koji se koristi za suenje unke i ribe
C C O
C C
H2C HC
CH2 CH
C OH
O C O C
O C N O C H
Amid
Aldehid
HCHO
Prema hemijskoj literuturi, procjenjuje se da organski spojevi ine vie od 90% od 50 miliona i neto vie ukupno do danas poznatih spojeva. (Chemical Abstract 2009)
laboratorijske vjebe
Otapalo za lakove; (Nemoj ga dovesti u kontakt sa plastikom i rayonom!) Aktivni sastojak alkoholnih pia; otapalo Sredstvo za tavljenje koe
Keton
Propanon (aceton)
Alkohol Amin Haloalkan (Alkilhalo genid) X=F, Cl, Br, I Eter Aren (aromatski karbohidr ogen)
Lokalni anestetik
CH3CH2OCH2CH3
CH3
Etoksietan (etileter)
Otapalo
Metilbenzen (toluen)
Meuprodukt; otapalo
OH
direktno vezana na benzenski ciklus
Fenol
OH
Dezinficijens
Generalna procedura klasine kvalitativne analize nepoznatog organskog spoja moe se podijeliti u nekoliko koraka:
ispitivanje fizikih osobina (izgled, boja, miris), ukljuujui tu i utvrivanje izvjesnih fizikih konstanti (taka topljenja, taka kljuanja, gustina, indeks loma svjetlosti, optika aktivnost) elementarna analiza; kvalitativno i kvantitativno odreivanje prisutnih elemenata i postavljanje molekularne formule preliminarna ispitivanja (topivost, relativna kiselost odnosno baznost, sagorljivost) detekcija karakteristinih funkcionalnih grupa pomou hemijskih reakcija koje ih prevode u karakteristine derivate ili su vezane s pojavama koje se naim ulima daju primijetiti (boja, miris) spektroskopske metode analize koje daju kljune informacije o strukturnim karakteristikama organske molekule sinteza karakteristinog analitikog derivata ispitivane supstance, ije fizike osobine treba da potvrde identitet nepoznate supstance
Cilj ovog eksperimenta nije identifikacija datog spoja kao hemijske individue, ve samo utvrivanje razliitih reaktivnih grupa u molekuli, to omoguuje da se nepoznati spoj uvrsti u jednu od potpuno definisanih klasa organsko-hemijske sistematike. S obzirom na ovako skromno postavljen cilj, mora i izbor supstanci za analizu biti vrlo ogranien na prilino malu listu lako pristupanih supstanci ija se svojstva nalaze u literaturi. U ovom eksperimentu, bie obuhvaeno samo nekoliko klasa organskih spojeva: alkani, alkeni, alkoholi, aldehidi, ketoni, karboksilne kiseline i fenoli. Ispitivanjem osobina poznatih spojeva iz svake od ovih klasa, dobie se kratak uvid u karakteristina svojstva svake klase spojeva, to e pomoi da se identificira nepoznati spoj poreenjem njegovih osobina sa osobinama poznatih
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
organskih spojeva. Pri interpretaciji rezultata vano je imati na umu da su negativni nalazi esto vani kao i pozitivni rezultati u identificiranju nepoznatog spoja. Svaki od izabranih testova na odreene funkcionalne grupe moe se izvesti uz mali utroak vremena i materijala, a da pri tome prui vane podatke o tome kojoj klasi dati spoj pripada. TESTOVI NA FUNKCIONALNE GRUPE Karbohidrogeni (ugljikovodici) Karbohidrogeni su najjednostavnija klasa organskih spojeva koji sadre samo atome karbona i hidrogena. Prema svojim strukturnim karakteristikama dijele se u dvije velike grupe: alifatski i aromatski. Alifatski karbohidrogeni se dalje mogu podijeliti na alkane, alkene i alkine koji imaju i svoje ciklike analoge. Alkani imaju karbonove atome povezane samo jednostrukim kovalentnim vezama i jo se nazivaju zasieni karbohidrogeni. Najjednostavniji predstavnik alkana i ujedno najjednostavniji organski spoj je metan koji ima samo jedan karbonov atom.
H H C H metan H
Alkani su klasa hemijski relativno inertnih spojeva koji pokazuju negativan test sa iodom kao gotovo univerzalnim reagensom na organske spojeve. Molekule koje sadre -elektrone ili nevezane elektronske parove grade sa iodom smee obojenu otopinu, kao posljedica stvaranja kompleksa izmeu ioda i raspoloivih elektrona u tim molekulama.
C C I2 :O: I2
Otopina ioda i zasienih spojeva koji nemaju raspoloivih elektrona i ne uestvuju u ovoj reakciji ostaje ljubiasta. Openito, izostanak jednostavnih reakcija za identifikaciju alkana, kao rezultat njihove hemijske indiferentnosti, je upravo njihov najvaniji znak raspoznavanja. Alkeni su nezasieni karbohidrogeni koji imaju jednu ili vie karbon-karbon dvostrukih veza u molekuli, dok je karakteristika alkina prisustvo karbon-karbon trostrukih veza. Ovi nezasieni karbohidrogeni su hemijski prilino reaktivni spojevi i vrlo lako stupaju u reakciju sa bromom koji se adira na njihove dvostruke, odnosno trostruke karbon-karbon veze. + Br Br C C Br C C C C + Br 2
crveno-sme bezbojan
Br
Potvrda prisustva nezasiene veze je iezavanje crveno-smee otopine broma. Alkeni i alkini takoe reaguju sa oksidirajuim reagensima kao to je KMnO 4 gradei dihidroksilne alkohole (1,2-diole). Test sa KMnO4 poznat je i pod nazivom Baeyerov test nezasienosti. Tamnoljubiasti permanganat se reducira do smeeg mangan(IV) oksida.
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
+ 2 MnO-4 + 4 H2O
ljubiast
C + 2 MnO 2 + 2 OH
sme
:OH :OH .. ..
Ovaj test nije strogo selektivan jer mu podlijeu i neke druge funkcionalne grupe koje se mogu oksidirati sa KMnO4 (fenoli, veina aldehida, 1o i 2o alkoholi itd.), iako sporije i pod neto snanijim uslovima (vea koncentracija KMnO4, via temperatura i razliita pH vrijednost otopine). Alkoholi Spojevi koji sadre hidroksilnu (-OH) funkcionalnu grupu vezanu na zasieni karbonov atom svrstavaju se u alkohole. Mogu se smatrati organskim derivatima vode u kojima je hidrogenov atom zamijenjen alkilnom grupom.
C O H
Prema vrsti karbonovog atoma koji nosi -OH grupu, alkoholi se mogu klasificirati kao primarni (1o), sekundarni (2o) ili tercijarni (3o). Kada je -OH grupa vezana na 1o karbonov atom, tj. onaj koji na sebe ima vezan samo jedan karbonov atom, alkohol se svrstava u primarne. Sekundarni alkoholi imaju -OH grupu vezanu na 2o karbon, koji je vezan na dva susjedna karbonova atoma, odnosno tercijarni alkoholi imaju 3o karbonov atom koji je vezan na tri druga karbonova atoma. R''
R CH2 OH R CH OH R C OH R' R'
2o alkohol 3o alkohol
1o alkohol
Strukturne razlike izmeu primarnih, sekundarnih i tercijarnih alkohola imaju posljedicu u razliitoj reaktivnosti ovih spojeva. Tako svi alkoholi ne podlijeu jednako djelovanju oksidirajuih reagenasa. Samo primarni i sekundarni alkoholi se mogu oksidirati uz gubitak dva hidrogenova atoma i nastanak karbonilnih spojeva: aldehida, odnosno ketona. Molekule tercijarnih alkohola nemaju H atom na karbonovom atomu koji nosi -OH grupu, tako da se ne mogu oksidirati dehidrogenacijom. Brz i jednostavan metod za razlikovanje primarnih i sekundarnih alkohola od tercijarnih alkohola je Jonesov oksidacioni test, koji koristi hromnu kiselinu kao oksidirajue sredstvo. Oksidirajui reagens, dihromat ion, Cr2O72-, je svijetlo narandast, a kada se redukuje deava se promjena boje u izrazito zelenu koja potie od hrom(III) iona, Cr3+.
RCH2OH ili R2CHOH + H2Cr2O7 H2SO4 Cr2(SO4)3 + RCOOH ili R 2C O
narandast
zelen
Test se zasniva na oksidaciji primarnih alkohola u aldehide i dalje u karboksilne kiseline, odnosno sekundarnih alkohola u ketone, dok se tercijarni alkoholi ne mogu oksidirati pod ovim uslovima. Pozitivan Jonesov oksidacioni test daju i aldehidi, ali ketoni ne. Primarni, sekundarni i tercijarni alkoholi mogu se meusobno razlikovati na osnovu brzine nastanka hloralkana (alkilhlorida), R-Cl, u reakciji sa Lucasovim reagensom koji predstavlja otopinu zink(II) hlorida, ZnCl2, u koncentrovanoj hloridnoj kiselini, HCl.
R OH + HCl
topiv
ZnCl 2
R Cl + H OH
netopiv
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Nii alkoholi se otapaju u reagensu, dok su odgovarajui hloralkani, R-Cl, netopivi u Lucasovom reagensu. Tercijarni alkoholi reaguju gotovo trenutno i hloralkan se pojavljuje kao zamuenje ili ak potpuno izdvojen sloj. Sekundarni alkoholi stvaraju zamuenje obino nakon 4-5 minuta, dok primarni alkoholi ne reaguju sa ovim reagensom kod sobne temperature. Primarni, sekundarni i tercijarni alkoholi koji imaju manje od 10 karbonovih atoma grade kompleks sa cer(IV) nitratnim ionom. Pozitivan test je indiciran trenutnom promjenom boje otopine od ute u crvenu. R-OH + [Ce(NO3)6]2ut Aldehidi i ketoni Funkcionalna grupa u aldehidima i ketonima je karbonilna grupa u kojoj su karbon i oksigen vezani dvostrukom vezom. U aldehidima je najmanje jedan hidrogenov atom vezan na karbonov atom u karbonilnoj grupi, dok su u ketonima oba atoma koja su vezana na karbonilnu grupu karbonovi atomi.
O C
karbonilna grupa
[R-O-Ce(NO3)5]2- + H+ + NO3crven
O R C H
aldehid
O R C R'
keton
Karbonilna grupa u aldehidima i ketonima je veoma reaktivna i ove dvije klase spojeva esto reaguju slino. Svi aldehidi i ketoni brzo reaguju sa, 2,4-dinitrofenilhidrazinom koji se jo naziva Bradyev reagens i grade slabo topive 2,4-dinitrofenilhidrazone. Boja ovih kristalnih derivata varira od ute do crvene, zavisno od prisustva drugih grupa u susjedstvu karbonilne grupe.
H NO2 + H2NNH NO2 H+ RC NNH ili R2C NNH NO2 NO2 NO2 NO2
H RC O ili R2C O
Pored velikog broja reakcija u kojima reaguju slino, aldehidi i ketoni se razliito ponaaju prema djelovanju blagih oksidirajuih reagenasa. Aldehidi se lako oksidiraju do kiselina koje imaju isti broj karbonovih atoma.
O R C H
aldehid
[O]
O R C OH
kiselina
Ketoni koji nemaju hidrogen vezan na karbonilnu grupu, mogu se oksidirati samo pod drastinijim uslovima (jai reagensi i vie temperature) poto njihova oksidacija do kiseline zahtijeva raskidanje karbon-karbon veze. Testovi koji slue za razlikovanje aldehida od ketona zasnivaju se upravo na injenici da se ove dvije klase spojeva oksidiraju pod razliitim uslovima. Reakcija srebrenog ogledala ukljuuje oksidaciju aldehida u odgovarajuu kiselinu uz upotrebu amonijakalne otopine srebro nitrata kao oksidirajueg reagensa. Ovaj reagens, poznat kao Tollensov reagens, reducira se do metalnog srebra koje se taloi na zidovima reakcione posude kao srebreno ogledalo.
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Ag2O
+ H2O + 2 Na+NO3-
2 Ag(NH3)2+OH-
O R C H + 2 Ag(NH3)2 OH
+ o
O
2 Ag + R C O- NH4+ + H2O + 3 NH3
Ovaj reagens je vrlo blag tako se da pored ketona, ni alkoholi ne mogu oksidirati pod ovim uslovima. Kao oksidirajui reagens koji se koristi za razlikovanje aldehida od ketona moe posluiti i bakar(II) ion, Cu2+, u alkalnoj otopini, kompleksiran sa K, Na-tartaratom, poznat kao Fehlingov reagens. Aldehidi reduciraju bakar(II) ion, Cu2+ u bakar(I) ion, Cu+. Otopina se pri tome mijenja iz plave u prljavo zelenu i postepeno se izdvaja crvenkasti talog bakar(I) oksida, Cu2O.
O R C H + 2 Cu2+ + 5 OHplav
K,Na-tartarat
O R C O- + Cu2O + 3 H2O
crven
Metilketoni se mogu razlikovati od drugih ketona pomou iodoform testa. Iodoform test ukljuuje hidrolizu i cijepanje metilketona, pri emu nastaje uti talog iodoforma, CHI3,
O R C CH3 + 3 I2 + 3 KOH
Pozitivan test daju i spojevi koji se lako oksidiraju do metilketona pod ovim reakcionim uslovima: 2 o alkoholi koji imaju metilnu grupu u susjedstvu hidroksilne grupe.
O
Acetaldehid je jedini od aldehida koji daje pozitivan test jer ima grupu za koju je karakteristina iodoform reakcija, kao i etanol koji se moe oksidirati do acetaldehida. Karboksilne kiseline Konani produkt oksidacije primarnih alkohola ili aldehida su karboksilne kiseline.
O R C OH
CH3 C
Karboksilna grupa COOH ima hidroksilnu OH grupu vezanu na karbonov atom karbonilne grupe, ali njena hidroksilna grupa, za razliku od alkoholne OH, pokazuje kisela svojstva. Tako karboksilne kiseline reaguju sa natrijum bikarbonatom, NaHCO3 i natrijum karbonatom, Na2CO3, i grade u vodi topive natrijumove soli i karbonsku (ugljinu) kiselinu koja se dalje raspada na vodu i karbon(IV) oksid (ugljendioksid), koji se oslobaa kao gas. Mjehurii izdvojenog gasa, CO 2, se kreu ka povrini otopine i to je propraeno karakteristinim umeim zvukom.
O R C OH + NaHCO 3
Ova reakcija moe posluiti za identifikaciju karboksilnih kiselina i posebno za razlikovanje od ostalih organskih spojeva kiselog karaktera kao to su fenoli koji se ne mogu neutralizirati bikarbonatom.
Hemija sa stehiometrijom
Fenoli
laboratorijske vjebe
Da bi se neki spoj klasificirao kao fenol, njegova molekula mora imati najmanje jednu -OH grupu direktno vezanu na benzenov prsten. Najjednostavniji lan ove familije, fenol, dao je ime cijeloj klasifenoli.
OH
fenol
Za razliku od alkohola koji takoe sadre -OH funkcionalnu grupu, fenoli su slabo kiseli i mogu se neutralizirati natrijum hidroksidom, a njihovi benzenovi prstenovi se lako oksidiraju. Test za dokazivanje fenolske funkcionalne grupe zasniva se na stvaranju obojenog kompleksa u prisustvu eljezo(III) iona, Fe3+. OH 3O Fe + 6 + Fe 3+ + 6H
6
ut
ljubiast
Pozitivan test daje veina fenola, a boja varira od intenzivno ljubiaste do crveno- smee ili zelene boje. ZADATAK VJEBE
Na uzorcima poznatih spojeva izvesti sve testove na funkcionalne grupe navedene u proceduri. Popuniti tabelu u Izvjetaju nedostajuim podacima o strukturi poznatih spojeva i navesti svoja zapaanja (boja reakcione smjese, pojava taloga i sl.) pri izvoenju pojedinih testova na funkcionalne grupe. U Izvjetaju opisati testove koji su izvedeni u cilju identifikacije funkcionalne grupe u uzorku nepoznatog spoja. HEMIKALIJE I REAGENSI
Indikator fenolftalein Elementarni iod, I2 Dihlormetan (metilenhlorid), CH2Cl2 Etanol, 96% Aceton 10% vodena otopina NaOH Brom u dihlormetanu, 2% otopina Br2 u CH2Cl2. Dihlormetan (metilenhlorid) se koristi umjesto uobiajenog otapala, tetrahlormetana (karbontetrahlorida), CCl4, jer je manje toksian. Otopina broma u dihlormetanu treba da je svjee pripremljena i uva se u tamnoj boci. Baeyerov reagens-1% vodena otopina permanganata, KMnO4 (0.06 mol/L)
Sve navedene reagense dobie pripremljene od laboranta, a ovdje je dat opis njihovog prireivanja u sluaju potrebe da to student uradi samostalno.
Hemija sa stehiometrijom -
laboratorijske vjebe
Jonesov reagens: Priredi suspenziju od 13.4 g CrO 3 u 11.5 mL koncentrovane H2SO4 i paljivo je dodaj, uz mijeanje, u toliko vode koliko je potrebno da ukupan volumen otopine iznosi 50 mL. Ovako prireeni reagens ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu prije upotrebe. Lucasov reagens: Otopi 16.0 g anhidrovanog zink(II) hlorida, ZnCl 2, u 10 mL koncentrovane hloridne kiseline, HCl, uz hlaenje na ledenom kupatilu. Cer-nitratni reagens: Otopi 4.0 g amonijum-cer(IV) nitrata, [(NH4)2Ce(NO3)6], u 10 mL otopine nitratne kiseline, 1.0 mol/L HNO3. Ako je potrebno, pripremu reagensa uradi uz zagrijavanje u cilju potpunog otapanja. Bradyev reagens: Otopi 1.0 g 2,4-dinitrofenilhidrazina u 5.0 mL koncentrovane H2SO4. Ova otopina se polako dodaje, uz mijeanje, u smjesu od 10 mL H2O i 35 mL 96% etanola. Nakon mijeanja, ako je potrebno, profiltriraj otopinu. Tollensov reagens-amonijakalna otopina srebro nitrata: Pripremi 5% vodenu otopinu AgNO3, 10 % vodenu otopinu NaOH i koncentrovanu otopinu amonijaka, NH 4OH, koji se pomijeaju neposredno prije upotrebe prema datoj proceduri. Vano: Viak Tollensovog reagensa treba unititi sa HNO3 jer moe stvoriti eksplozivne fulminate! 3 Ag2O + 2 NH3 (aq) 2 Ag3N + 3 H2O
eksplozivan
Fehlingov reagens : Otopina I: 36.64 g kristalnog bakar(II) sulfata, CuSO4, otopi u vodi koja sadri par kapi razblaene sulfatne kiseline i dopuni otopinu vodom do 500 mL. Otopina II: Otopi 60 g istog natrijum hidroksida, NaOH, i 173 g kalijum, natrijum-tartarata (Roshelleova so) u vodi, filtriraj kroz sinterovani stakleni lijevak i dopuni otopinu vodom do 500 mL. Obje otopine se uvaju odvojeno, dobro zatvorene i neposredno prije upotrebe se pomijeaju isti volumeni otopine I i II. Iod u kalijum iodidu: Otopi 10 g kalijum iodida, KI i 5 g elementarnog ioda, I 2, u 40 mL vode. 1% vodena otopina natrijum bikarbonata, NaHCO3 FeCl3-reagens: 1% neutralna otopina eljezo(III) hlorida (osloboena HCl) prireuje se dodatkom razblaene otopine natrijum hidroksida u osnovnu otopinu 1% FeCl3 dok se ne stvori talog eljezo(III) hidroksida, Fe(OH)3. Odfiltriraj talog i za test upotrijebi bistar filtrat. PRIBOR I OPREMA epruvete, manje Pasterove pipete porculanska ploica za testove vodeno kupatilo (aa sa vodom) termometar indikator papir
MJERE OPREZA Za sve spojeve koje dobije kao poznate uzorke, koristei se raspoloivim prirunicima ili komercijalnim katalozima (konsultuj asistenta!), uz podatke o strukturi i fizikim svojstvima, prikupi informacije o toksinim i/ili zapaljivim svojstvima koja ukljuuju i specifine mjere opreza pri radu. Pri identifikaciji nepoznatog organskog spoja, uvijek imaj na umu da bilo koji takav spoj ima potencijalno opasna svojstva i sve hemijske testove obavljaj uz mjere opreza koje su neophodne u radu sa toksinim i zapaljivim supstancama! Mnogi organski spojevi su zapaljivi i brzo reaguju sa oksigenom u prisustvu vatre ili iskre. Tokom izvoenja eksperimenta eliminii otvoreni plamen u blizini.
10
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Iod i posebno brom su veoma toksini i mogu izazvati opekotine na koi ili udisanjem njihovih para. Obavezno radi u digestoru i koristi zatitne rukavice. Neki od reagenasa se pripremaju uz upotrebu koncentrovanih mineralnih kiselina. Pridravaj se optih pravila o radu sa ovim agresivnim hemikalijama. Hlorirana otapala, kao dihlormetan (metilenhlorid), CH2Cl2, su toksini i mogue kancerogeni. Izbjegavaj udisanje njihovih para i obavezno radi u digestoru. Mnogi spojevi hroma (VI) su mogue kancerogeni. Izbjegavaj kontakt sa prahom hrom(VI) oksida, CrO3. Otopina srebro nitrata izaziva tamne mrlje na koi. Koristi zatitne rukavice. IZVOENJE VJEBE U cilju identifikacije nepoznatog organskog spoja, dobie od asistenta JEDAN uzorak koji predstavlja monofunkcionalni organski spoj (ima samo jednu funkcionalnu grupu), to ga svrstava u jednu od klasa organskih spojeva koje imaju svoje predstavnike meu poznatim uzorcima koji e Ti biti na raspolaganju. Spisak moguih supstanci koje mogu biti date kao poznati uzorci organskih spojeva: alkani: heksan, pentan, metilcikloheksan alkeni: penten-1, penten-2, cikloheksen aldehidi: benzaldehid, propanal, formaldehid, glukoza ketoni: aceton, cikloheksanon, acetofenon, metil etil keton alkoholi: etanol, cikloheksanol, terc.butanol, n-butanol fenoli: fenol karboksilne kiseline: acetatna kiselina, benzojeva kiselina, buterna kiselina Kako ne postoji neko jedinstveno uputstvo za rad sa nepoznatim uzorkom, data je shema koja moe biti pomo u planiranju redoslijeda hemijskih reakcija potrebnih u cilju identifikacije funkcionalnih grupa (Slika 25.2). Na bazi tako dobivenih rezultata treba izvesti i druge testove za potvrdu prisustva pojedinih funkcionalnih grupa. Sve testove na nepoznatom uzorku izvodi paralelno sa poznatim spojem koji daje POZITIVAN test i sa kontrolnom probom (koja sadri otapalo i reagens, ali BEZ analiziranog uzorka) i koja daje NEGATIVAN test . Na ovaj nain je olakana interpretacija pozitivnih reakcija, a eventualno oneieni ili nedovoljno svjei reagensi mogu se tako otkriti i zamijeniti novim. Vrlo je vano da detaljno opie sva svoja opaanja i rezultate pri izvoenju svakog pojedinanog testa i to prikae u Izvjetaju.
Pri izvoenju hemijskih testova, svi reagensi se uzimaju pomou kapaljke ili Pasterove pipete.
11
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
e s t
s a
(+
) a H
(- ) a l k a n a l k e n a l d e h i d a l k o h o l k e t o n f e n o l T ( - ) a l k a n k e t o n a l k o h o l T e s t s a 2 , 4 - d i n e s t s a4 K M ( + ) a l k e n a l d e h i d f e n o l n O
( - ) a l k a n a l k o h o l T e s t s a
( + ) n i t r o f e n i l hT i e d s r t a s3z a i n F f o e e m C o l l ( - ) ( + ) a l k e n k e t o n a l d e h i d 2 , 4 - d i n i t r o f e n i l h i d r a z i n o m ( + l d e h i d o m )
I o d o f o r m t e s t c e ( r - - ) n i t r ( a + t )o m T e s t s a ( + ) N I J mE e t i l ( - ) ( - ) a l k a na l k o hm o el t k i l e t o n a l k e n k e t o n e s t ( - ) a l k 1o s a i o d o m s a d T
aT n e s t ( +
o
) i 2
( - ) a l k o
3
o
a l
a e s t s a b r o m ( + ) e i h r o m a tl ok m n T e s t s a r e a g e h o l ( + k o h o l t e s t
F e h l i n g o v i m n s o m )T e s t s r e b r e n o g o g l e d a l a ( + )
c a s o v
t r e n u t n o
o
a l d
e h i d
12
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
TEST SA IOD-KOMPLEKSOM Na bijelu porculansku ploicu stavi mali kristal ioda, a zatim dodaj 23 kapi ispitivane tenosti. Alkani daju negativan test i ljubiasta boja ioda ostaje nepromijenjena. Svi ostali organski spojevi koji grade kompleks sa iodom daju smee obojenu otopinu.
Napomena: Test se izvodi samo na tenim uzorcima.
TEST SA BROMOM U manju epruvetu unesi 2 kapi nepoznate ispitivane tenosti (ili par kristalia ako je uzorak vrst) i otopi ih u 0.5 mL dihlormetana. Dodaj 2 kapi 2% otopine broma u dihlormetanu, uz mukanje. Gubitak crvenosmee boje broma je dokaz prisustva nezasienog karbohidrogena.
Napomena: Nemoj udisati pare reagensa i obavezno izvodi test u digestoru.
TEST SA PERMANGANATOM: BAEYEROV TEST NEZASIENOSTI U manju epruvetu otopi 2 kapi ispitivanog uzorka u 0.5 mL istog acetona (bez primjesa alkohola) i dodaj 2-3 kapi 1% otopine KMnO4, uz mijeanje. Pozitivan test nezasienosti je promjena ljubiaste boje permanganata u talog smeeg mangan(IV) oksida, MnO2.
Napomena: Test je negativan ako se ne obezbojava vie od 3 kapi otopine permanganata.
TEST SA HROMNOM KISELINOM: JONESOVA OKSIDACIJA Otopi 2 kapi ispitivane tenosti (ili par kristalia ako je uzorak vrst) u 0.5 mL istog acetona u manjoj epruveti i ovoj otopini dodaj 2 kapi Jonesovog reagensa (hromna kiselina u sulfatnoj kiselini). Promijeaj otopinu i prati promjenu boje. Pozitivan test je nastanak zelene boje par sekundi nakon dodatka narandasto-utog reagensa. LUCASOV TEST U manjoj epruveti pomijeaj 3 kapi ispitivane tenosti sa 2 mL Lucasovog reagensa. Dobro izmukaj otopinu i ostavi da malo odstoji. Posmatraj promjenu reakcione smjese i na osnovu vremena potrebnog za pojavu zamuenja ili izdvajanje netopivog sloja, klasificiraj ispitivani uzorak kao 1o, 2o ili 3o alkohol.
Napomena: Poto se kao sporedni produkt reakcije izdvaja HCl, test izvedi paljivo u digestoru.
TEST SA AMONIJUM-CER(IV) NITRATOM Tri kapi ispitivanog spoja dodaj u epruvetu u kojoj se nalazi 0.5 mL reagensa amonijum cer(IV) nitrata i promukaj sadraj epruvete. U
13
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
sluaju pozitivne reakcije, blijedouta boja reagensa prelazi crvenu, koja potie od nastalog kompleksa koji je topiv u vodi.
Napomena: Ukoliko ispitivani uzorak nije topiv u vodi, bie prisutna dva sloja. Crvena boja u jednom od slojeva, indikacija je pozitivnog testa.
TEST SA 2,4-DINITROFENILHIDRAZINOM: BRADYEV TEST U manjoj epruveti otopi 3 kapi ispitivanog uzorka u 0.5 mL etanola i zatim dodaj 1 mL reagensa 2,4-dinitrofenilhidrazina. Dobro promijeaj smjesu i ostavi da stoji par minuta. Stvaranje uto do crveno obojenog taloga 2,4-dinitrofenilhidrazona je pozitivan test na karbonilne spojeve.
Napomena: Ponekad prvo nastane uljasti talog, ali nakon stajanja postane kristalian.
TEST SREBRENOG OGLEDALA: TOLLENSOVA REAKCIJA U istu epruvetu odpipetiraj 1.0 mL 5% otopine AgNO3 i dodaj 1 kap 10% otopine NaOH. Nastali talog srebro oksida otopi u minimalnoj koliini koncentrovane otopine amonijaka (2-4 kapi), uz mijeanje. Bistroj otopini dodaj 1 kap ispitivane tenosti (ili par kristalia ako je uzorak vrst), uz mijeanje i ostavi reakcionu smjesu da stoji 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ako nema reakcije, stavi epruvetu u vodeno kupatilo (aa sa vodom), zagrijano na 40oC, 5 minuta. Nastanak srebrenog ogledala je pozitivan test.
Napomena: - Epruveta treba da je temeljito oprana, jer u protivnom nee nastati sloj srebrnog ogledala na zidovima epruvete, ve e se elementarno srebro istaloiti kao tamni prah na dnu. - U pripremi reagensa, izbjegavaj upotrebu vika amonijaka. - Tollensov reagens se uvijek koristi svjee pripremljen jer nakon stajanja moe da se raspada, uz stvaranje eksplozivnog AgN3! - Viak reagensa treba unititi sa HNO3- konsultuj asistenta! - Nitratna kiselina takoe uklanja srebrno ogledalo nastalo u epruveti i nakon izvedenog testa, odmah isperi epruvetu razblaenom otopinom HNO3.
TEST SA FEHLINGOVIM REAGENSOM Dvije kapi ispitivane tenosti (ili par kristalia ako je uzorak vrst) i 2 mL Fehlingovog reagensa (prireenog mijeanjem jednakih volumena otopine I i II, neposredno prije upotrebe) zagrij u epruveti, na kljualom vodenom kupatilu, tokom 3-4 minute. U sluaju pozitivnog testa, izdvaja se crveni talog bakar(I) oksida, Cu2O. IODOFORM TEST Otopi samo 1 kap ispitivane tenosti (ili kristali ako je uzorak vrst) u 0.5 mL vode i dodaj 0.5 mL 10% otopine NaOH.
14
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Napomena: Ukoliko uzorak nije topiv u vodenoj fazi, ili snano promukaj otopinu, ili dodaj par kapi dioksana (obavezno u digestoru!) ili 1,2-dimetoksietana da bi se otopina homogenizirala.
Nakon otapanja uzorka, dodaj polako, u kapima i uz mijeanje, otopinu ioda u kalijum-iodidu, dok se tamno smea boja otopine ne zadri (1-2 mL I2 /KI). Ostavi reakcionu smjesu da stoji 2-3 minute. Ako se ne izdvoji talog iodoforma kod sobne temperature, zagrij epruvetu par minuta na vodenom kupatilu na 60oC. Ukoliko boja ioda iezne, nastavi dodavati reagens dok se smea boja, koja potie od neizreagiranog ioda, ne zadri. Viak ioda ukloni dodatkom par kapi razblaene otopine NaOH, uz mukanje i ostavi reakcionu smjesu da stoji 10 minuta. Izdvajanje utog taloga iodoforma, karakteristinog mirisa, je dokaz pozitivnog testa. TEST KISELOSTI POMOU INDIKATORA a) Na komad plavog lakmus papira, nakvaenog destilovanom vodom, stavi kristal ili kap vodene otopine ispitivane supstance. Ukoliko uzorak nije topiv u vodi, upotrijebi alkoholno-vodenu smjesu ili ist alkohol. Promjena boje plavog lakmusa u crvenu govori o kiselom karakteru supstance. b) Na bijelu porculansku ploicu stavi 1 kap otopine fenolftaleina kome je predhodno dodata minimalna koliina razblaene otopine NaOH (0.01 mol /L) da bi postao crven. Na tu kap dodaj malo ispitivane supstance. Ako se kap obezboji, test je pozitivan, tj. supstanca ima kiseo karakter. TEST SA NATRIJUM-BIKARBONATOM Dodaj oko 0.2 g nepoznatog spoja u oko 1 mL 5% vodene otopine natrijum bikarbonata. Oslobaanje karbon dioksida, CO2, dokaz je prisustva karboksilne grupe. TEST SA ELJEZO(III) HLORIDOM Zavisno od osobina topivosti, 3 kapi ispitivanog spoja (ili par kristalia ako je uzorak vrst), otopi u epruveti u 0.5 mL vode ili etanola (ili smjese voda-etanol, 1:1) i zatim dodaj 1-2 kapi 1% neutralne otopine FeCl3. Pozitivan test je promjena ute boje reagensa u crvenu, ljubiastu ili zelenu.
Napomena: Prije dodatka reagensa, indikator papirom provjeri pH otopine. U prisustvu fenola, pH treba da je ispod 7.
15
Hemija sa stehiometrijom
PRIPREMNA VJEBANJA
laboratorijske vjebe
2. Ispii strukturne formule za sva etiri alkohola molekularne formule C4H9OH i oznai svaki kao
1o, 2o ili 3o alkohol.
3. Navedi funkcionalne grupe koje su prisutne u slijedeim spojevima: a) b) c) O C H CH2 C O H CH3 C CH2CH3 d) OH e) f) O CH3 C O C OH CH O CH CH CH CH 3 2 2 2 3
16
Hemija sa stehiometrijom
REZULTATI TESTOVI SA POZNATIM SPOJEVIMA
Ime spoja Strukturna formula
laboratorijske vjebe
Opaanja i rezultati
PITANJA:
17
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
1. Koristei se testovima u ovom eksperimentu, predloi hemijsku reakciju kojom moe razlikovati
spojeve u parovima: a) pentan i penten-1 ___________________________________________________________________ b) 2-pentanon i 3-pentanon ___________________________________________________________________ c) 3-pentanon i pentanal ___________________________________________________________________ d) aceton i cikloheksanon ___________________________________________________________________ e) benzaldehid i acetofenon (fenil metil keton) ___________________________________________________________________ f) benzaldehid i salicilaldehid (2-hidroksibenzaldehid) ___________________________________________________________________ g) etanal i propanal ___________________________________________________________________ h) etanol i fenol ___________________________________________________________________ i) terc.butanol i n-butanol ___________________________________________________________________ j) fenol i benzojeva kiselina ___________________________________________________________________
OVJERA VJEBE:
18
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
19
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
nastaju produkti (boja moe varirati od ute preko smee do crne ovisno o visini temperature i vremenu zagrijavanja) uz izdvajanje karakteristinog i ugodnog mirisa. Temperatura topljenja (preciznije temperatura raspadanja) kao fizika konstanta takoer slui pri identifikaciji eera. Fermentacija - pri djelovanju kvasca na otopine veine monosaharida, nekih disaharida i oligosaharida, dolazi do selektvne fermentacije. Ovisno o prisustvu odgovarajuih enzima u pekarskom ili pivskom kvascu fermentacija moe biti alkoholna i mlijeno-kiselinska. Kod prve nastaje etanol, a kod druge kojoj podlijee mlijeni eer laktoza nastaje mlijena kiselina. Savremene metode za kvantitativno odreivanje eera u dijagnostici i lijeenju temelje se i na primjeni specifinih enzima koji u reakciji sa supstratom (eerom) stvaraju produkt ije se nastajanje moe pratiti pogodnom metodom (najee spektorfotometrijski). Koliina tog produkta srazmjerna je koliini prisuutnog eera u uzorku. Jedan takav set za odreivanje nivoa glukoze u krvi je Glucose Flex TM reagent catridge, Dimension sistem klinike hemije, kompanije Dade behring Inc.
1. Trommerova reakcija
Na ispitivanu probu (1-2 ml otopine eera) dodaje se isti volumen 2 M NaOH i uz mjeanje toliko 0,25 M otopine CuSO4 dok se ne stvori talog Cu(OH)2 koji se vie ne otapa. Zagrijavanjem, reducirajui eeri izdvajaju crveni talog Cu2O:
2. Fehlingova reakcija
U epruvetu sipati 1 ml reagensa Fehling I i Fehling II i zagrijavati na kljualom vodenom kupatilu nekoliko minuta. Zatim dodati ispitivanu otopinu eera i ukoliko se odmah ne pojavi crveni talog Cu2O nastaviti grijati.
-Fehling I: vodena otopina bakar(II)-sulfata (6,25 g CuSO4x5H2O u 100 ml H2O) -Fehling II: alkalna otopina kalijum-natrijum tartarata (15 g NaOH i 5 g soli u 100 ml H2O)
20
laboratorijske vjebe
U epruvetu se stavi 1,5 ml Benedictovog reagensa i nekoliko kapi ispitivane probe i zagrijava 2 minute na kljualom vodenom kupatilu. Crveni talog Cu2O dokaz je prisustva reducirajuih eera. Benedictov reagens: 1. Otopi se 173 g bezvodnog Na-citrata i 90 g bezvodnog Na-karbonata u 600 ml destilovane vode uz grijanje. Po potrebi se filtrata. Nadopuniti sa destilovanom vodom do 850 ml. 2. otopi se 17,3 CuSO4x5H2O u 150 ml H2O. Nakon toga otopina 1, postepeno, uz mjeanje, dodaje se u otopinu 2.
4. Nylanderova reakcija
Na 2 ml ispitivane itopine dodaje se 0,5 ml Nylanderova reagensa i zagrijava do pojave smeeg do crnog taloga od izdvojenog bizmuta:
Nylanderov reagens: otopi se 4g K-Na tartarata u 100 ml 10 %-og NaOH. Tome se dodaje 2 g bizmutnitrata i zagrijava. Nakon toga filtrirati i ohlaeni filtrat koristiti kao reagens.
1. Molischeva reakcija
Molischeva reakcija je opa reakcija na prisustvo eera. Negativna proba iskljuuje njihovo prisustvo u ispitivanom uzorku. Temelji se na dehidratacionom djelovanju koncentriranih kiselina pri emu nastaje furfural ili njegovi derivati koji sa -naftolom daju obojene spojeve.
21
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Postupak: na 2 ml ispitivane otopie dodati nekoliko kapi Molischeva reagensa, potresti i vrlo paljivo, niz zidove epruvete dodati 3 ml konc. H2SO4. Na dodirnom sloju dvije tenosti javlja se crvenoljubiasto obojenje, koje ukazuje na prisustvo eera.
1. Tauberova reakcija
Ova reakcja je selektivno pozitivna na pentoze. Reagens sadri benzidin u koncentrovanoj acetatnoj kiselini. Postupak: na 0,5 ml pentoze (arabinoza, riboza, ksiloza) dodati 2 ml Tauberovog reagensa, zagrijati do kljuanja do smanjenja volumena na polovicu. Epruvetu zatim uroniti u hladnu vodu i dopuniti vodom na polazni volumen. U toku nekoliko sekundi javlja se vrlo stabilna svijetlo-crvena boja.
2. Bialova reakcija
Ova reakcija je pozitivna na pentoze, a reagens sadri orcinol i eljezo(III)-hlorid u HCl. Postupak: Na 1,5 ml pentoze dodati 2,5 ml reagensa i grijati na kljualom vodenom kupatilu. Pentoze zagrijavanjem sa HCl daju furfural koji se u prisustvu feri jona kondenzira sa orcinolom (1,3-dihidroksi-5metilbenzen) pri emu se javlja zeleno obojeni kompleks. Ponoviti reakciju sa glukozom i ustanoviti negativan test.
Fermentacija
Na suspenziju kvasca u vodi dodati otopinu koja se ispituje (2 %-nu fruktozu). Zatvoriti epruvetu (tzv. patkicu), okrenuti je i drati u termostatu pri 37 C. Nakon 30 minuta zapaaju se mjehurii izdvojenog CO2, koji idu prema vrhu epruvete i potiskuju tenost. Dok se ekaju ova zapaanja,
22
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
pripremiti eksperiment fermentacije na sljedei nain: na 2 ml 2 %-ne fruktoze dodati 2 kapi indikatora fenol-crveno i nekoliko kapi 1 %-og Na-karbonata (do crvenog obojenja) te staviti na termostat pri ve podeenoj temperaturi. Kada nastupi fermentacija boja indikatora prelazi u utu.
1. Sa 1-2 ml otopine saharoze izvesti neku od reducirajuih proba (npr. Trommerovu ili Benedictovu) i zabiljeiti ishod. Nakon toga, na 5 ml otopine saharoze dodati 0,5 ml konc. HCl i zagrijavati 20-30 minuta na kljualom vodenom kupatilu. Ohladiti i hidrolizat neutralizirati zasienom otopinom Nakarbonata. 2. Na neutraliziranoj otipini izvesti Benedictovu probu i konstatirati prisustvo reducirajuih grupa, nastalih hidrolitikom cijepanjem glikozidne veze.
3. ZADACI I VJEBE
-Odgovorite na slijedea pitanja: 1. Prikazati ciklinu sturkturu D-glukoze?
2. Koji od navedenih ugljikohidrata e dati pozitivnu (+) ili negativnu (-) reakciju sa navedenim reagensima? Benediktova reakcija Glukoza Fruktoza Galaktoza Saharoza Laktoza Maltoza Izvriti eksperimentalni dio vjebe Selivanov test Fermentacija Reakcija sa jodom
4. REZULTATI
Odreivanje redukcionih osobina monosaharida i disaharida 1. Tromerova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Felingova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 3. Benedictova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
23
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
4. Nylanderova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 5. Reakcija srebrnog ogledala __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
1. Molischeva reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Seliwanov test-razlikovanje ketoza i aldoza __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
1. Tauberova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Bialova reakcija __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
Fermentacija
24
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
OVJERA VJEBE:
25
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
1. Taloenje alkoholom
krob se taloi 95 %-tnim etanolom tako to se na odreeni volumen suspenzije kroba u vodi dodaje isti volumen etanola. Otopina se promuka i ostavi da se izvri taloenje, a zatim talog odvoji filtriranjem. Na filtrat i na talog izvesti reakciju sa jodom. Glikogen se taloi na isti nain kao i krob uz due stajanje.
2. Taloenje amonijum-sulfatom
26
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Na odreeni volumen kroba dodaje se isti volumen zasienog rastvora (NH4)2SO4. Dobro promuka i ostavi da stoji neko vrijeme. krob se taloi, a supernatant daje negativnu reakciju sa jodom.
2. Reakcija na glikogen
Na 5 ml suspenzije glikogena dodavati kap po kap Lugolovog reagensa. Javlja se crvenkasto smea boja. Ukoliko je pojava boje oteana moe se dodati 1 kap 10 %-nog NaCl i jo nekoliko kapi reagensa.
Hidroliza kroba provodi se u kiseloj sredini uz zagrijavanje. Na nekoliko mililitara vodene otopine kroba doda se 2-3 ml HCl (3 mol/dm3) i stavi u kljualo vodeno kupatilo. Poslije svaka dva minuta uzima se po nekoliko kapi hidrolizata i izvodi proba Lugolovim reagensom. Oznai se vrijeme koje je potrebno za prvu promjenu boje sa krobom i nastave probe sve dok reakcija sa jodom ne postane negativna. Dio finalnog hidrolizata neutralizirati sa Na2CO3 i izvesti jednu od reducirajuih reakcija, iji e pozitivni test ukazati da je krob razloen na disaharid maltozu, odnosno monosaharid glukozu.
Hidroliza kroba
Napomena
Tokom hidrolize krob daje sljedee meuproizvode: amilodekstrine, koji sa jodom daju crvenosmee obojenje; eritrodekstrine-sa jodom daje purpurnocrveno obojenje; ahrodekstrine-sa jodom ne daju boju; maltozu i glukozu-sa jodm ne daju boju, ali daju pozitivne redukujue probe. Proizvodi hidrolitike razgradnje kroba mogu se utvrditi na primjer u hljebu. Na nekoliko komadia hljeba dodati vodu, homogenizirati, ostaviti da stoji izvjesno vrijeme, filtrirati kroz gazu, a zatim kroz filter-papir. Sa malom koliinom filtrata izvesti jodnu probu, ija purpurnocrvena boja ukazuje na nastali eritrodekstrin tokm peenja hljeba. Maltoza i glukoza nastaju hidrolitikom transformacijom jednog dijela kroba iz brana pod uticajem enzima amilaze iz penice, koja se aktivira temperaturom u toku procesa kvasanja hljeba. U hljebu dakle, postoje istovremeno, krob, dekstrini, maltoza i glukoza, jer proces kvasanja i peenja uslovljava prelaz jednog dijela kroba u njegove razgradne proizvode.
Hidroliza celuloze
U posudu za hidrolizu staviti usitnjeni filter papir ili mikrokristalinu celulozu i dodati oko 3 ml hloridne kiseline (6 mol/dm3). Dobija se gusti sirup, koji se paljivo sipa u vodu (oko 5 ml) i pusti da kljua 30 minuta. Ohladiti, neutralizirati 10%-tnim NaOH (paljivo uz lakmus papir). Na neutralnom hidrolizatu izvesti neku od redukujuih proba.
Napomena: tokom hidrolize iz celuloze nastaju celobioza i glukoza, koje imaju redukujua svojstva. 3. ZADACI I VJEBE
-Odgovorite na slijedea pitanja:
27
laboratorijske vjebe
1. Taloenje alkoholom __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Taloenje amonij-sulfatom __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
Reakcije sa jodom
28
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Hidroliza kroba
Hidroliza celuloze
OVJERA VJEBE:
29
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Vjeba broj 4
KVANTITATIVNO ODREIVANJE GLUKOZE POLARIMETRIJSKOM METODOM (ODREIVANJE SADRAJA GLUKOZE (IZRAEN U %) U NEPOZNATOM UZORKU) 1. TEORETSKI UVOD
Polarimetrija je optika metoda pomou koje se prati zakretanje ravni polarizirane svjetlosti. To zakretanje ravni polarizirane svjetlosti naziva se optika rotacija, a jedinjenje koje zakree ravan je optiki aktivno jedinjenje. Jedinjenja koja se meusobno razlikuju prema poloaju atoma i atomskih grupa u prostoru zovu se stereoizomeri. Ukoliko su ti stereoizomeri i optiki aktivni, zovu se enantiomeri ili optiki izomeri. Veliina i pravac skretanja ravni polarizovane svjetlosti koje prolazi kroz rastvor neke asimetrine supstance je reprodukujua i stalna veliina i moe se kvantitativno odrediti. Skretanje ravni polarizovane svjetlosti moe da bude desno (u pravcu kazaljke na satu) i lijevo (suprotno o pravca kazaljke na satu). Supstanca koja skree desno ima desnu rotaciju i obiljeava se sa (+), a supstanca koja skree lijevo ima lijevu rotaciju i obiljeava se sa (-). Uslov za asimetriju jednog organskog molekula je prisustvo jednog asimetrinog centra u molekuli, odnosno atoma ugljika sa kod kojeg su sve etiri valencije zasiene razliitim grupama ili radikalima. U takvom sluaju ne moe se kroz centar molekule postaviti nijedna ravan koja bi mogla dati sliku u ogledalu. Osnovu asimetrije kod eera ine asimetrini C-atomi u molekulu. Najrasprostranjenija aldoza sa asimetrinim C-atomom u molekulu je glicerinski aldehid koji ima dva optiki aktivna izomera. (Lizomer i D-izomer). eeri koji na asimetrinom C-atomu, najvie udaljenom od karboksilne grupe, imaju strukturnu konfiguraciju L- ili D-glicerinskog aldehida spadaju u L-, odnosno D- sterikog rada bez obzira na rotaciju ravni polarizovane svjetlosti. Npr. D-glukoza moe biti u zavisnosti od rotacije D(+)-glukoza ili D(-)-glukoza. Fruktoza spada u desni steriki red, a zakree ravan polarizovane svjetlosti ulijevo. (D(-)-fruktoza). Instrument pomou kojeg se odreuje vrijednost ugla zakretanja ravni polarizirane svjetlosti zove se polarimetar. Elementi polarimetra su: Izvor svjetlosti Soivo Prizma-polarizator elija sa rastvorom optike supstance Pravac polarizovane svjetlosti Prizma-analizator Skala Okular Polarizirana svjetlost nastaje kada se svjetlost odreene valne duine iz vidljivog dijela elektromagnetnog spektra propusti kroz sistem Nikolovih prizmi. Znak polarizovane svjetlosti, ute svjetlosti iz svjetlosnog izvora prolazi kroz sabirno soivo i pada na nepokretnu prizmu, izraenu od kalcita koja ima osobinu dvostrukog prelamanja svjetlosti. Ona je polarizator svjetlosti. Polarizovani zrak svjetlosti iz polarizatora dolazi na drugu prizmu, koja se okree oko svoje horizontalne ose. Iz analizatora zrak kroz sistem soiva dolazi do oka posmatraa.
30
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
31
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Najee se koristi svjetlost valne duine 589,3 nm (natrijumova D linija). Specifini ugao rotacije ( [ ] T ) za neku optiki aktivnu tvar izraunava se iz izmjerenog ugla rotacije na polarimetru () D pomou slijedee formule:
[ ] T D
gdje je:
l c
l duina kivete (dm) T termodinamika temperatura D valna duina volframove lampe koja odgovara utoj natrijevoj liniji pri 589,3 nm. c koncentracija tvari (g/cm3) Mnogi optiki aktivni spojevi daju otopine kod kojih se vrijednost ugla zakretanja ravni polarizirane svjetlosti mijenja tokom vremena. Ova pojava, koja se naziva mutarotacija (lat. mutare = mijenjati) posljedica je aldehid-poluacetalne ravnotee:
O CH2OH O HO OH OH OH C HO OH OH CH2OH HO H OH CH2OH O OH OH OH
-D-glukoza
D-glukoza
(lanani oblik)
-D-glukoza
Svjee pripremljena otopina -D-glukoze ima specifini ugao zakretanja +112, a -D-glukoze +18,7. Tokom vremena bilo koji od ova dva oblika glukoze mutarotacijom dostigne konanu vrijednost specifinog ugla zakretanja od +52,7. Prema tome, oblik glukoze koji pokazuje specifini ugao zakretanja od +52,7 predstavlja u stvari ravnotenu smjesu i oblika.
2. EKSPERIMENTALNI DIO
Potrebni reagensi
Uzorak glukoze za analizu moe biti razliit: krv, urin (kod dijabetiara), sokovi (ovdje treba naglasiti da je u sokovima velika zastupljenost i drugih eera tako da bi izmjereni ugao predstavljao ukupnu optiku aktivnost) itd. U ovoj vjebi uzorak za analizu bie pripremljen od strane laboranta otapanjem odreene mase tehnike glukoze u poznatom volumenu destilirane vode. Standard-D(+)-glukoza, anhidrovana, Semikem Sarajevo,
Polarimetar (na raspolaganju je model D polarimetar, Bellingham + Stanley Limited, England) sa izvorom napajanja za volframovu lampu i kivetom za uzorak
32
Hemija sa stehiometrijom -
laboratorijske vjebe
Vaga (obzirom da se radi o procentnim koncentracijama, opravdano je koristiti tehniku vagu boljih karakteristika), na raspolaganju je model CENT-0-GRAM balance, kompanije OHAUS , Florham Park, N.J. 07932, USA, kapacitet 311 g, ae od 100 ml (5 kom.) menzura od 50 ml stakleni tapi
Optika metoda koja e se koristiti je polarimetrija. Detektija se ostvaruje oitavanjem ugla zakretanja vri se na odgovarajuoj mjernoj skali koja je povezana sa analizatorom. PROCEDURA ZA RAD Pripremiti po 50 ml 5 %, 10 %, 15 % i 20 %-tne otopine glukoze i drati 30 minuta na temperaturi 40 50 C, da bi se mutarotacija svela na minimum (U svrhu dobijanja boljih rezultata otopine se pripreme 24h prije mjerenja i ostave na temperaturu od 2 8 C). Prije rada sa otopinama potrebno je nai korekciju (odstupanje od nule na mjernoj skali) polarimetra pomou destilirane vode. Nakon toga za svaku otopinu izmjeriti ugao zakretanja na polarimetru i nacrtati grafik na milimetarskom papiru gdje je = f(c), gdje je mjereni ugao, a c koncentracija glukoze u g/100 ml, odnosno u %. Zatim se mjeri ugao zakretanja otopine glukoze nepoznate koncentracije i na osnovu kalibracione krive oitava ta koncentracija koja se moe dobiti i raunskim putem koristei se T jednainom pravca kalibracione krive. Povezanost mjerenog () i specifinog ( [ ] D ) ugla zakretanja i koncentracije (izraene u % za otapala gustoe priblino 1 g/cm3) takoer je data jednainom:
c=
gdje je:
100 [ ] T l D
l duina kivete (dm) T termodinamika temperatura D valna duina volframove lampe koja odgovara utoj natrijevoj liniji pri 589,3 nm. [ ] T za vodenu otopinu D-glukoze pri 25 C i uz upotrebu volframove lampe preraunat na D koncentraciju 1 g/ml (100%) iznosi 52,7.
3. ZADACI I VJEBE
- Odgovorite na slijedea pitanja: 1. ta je stereoizomer, a ta enantiomer! __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ 2. Koja je razlika izmeu ugla zakretanja i specifinog ugla zakretanja i emu slue ovi parametri? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
33
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
3. Koristei se podacima navedenim za specifine uglove zakretanja anomernih oblika glukoze (u teorijskom dijelu) izraunaj procentualnu zastupljenost tih oblika glukoze u stanju ravnotee!
(H2O)
Izvriti eksperimentalni dio vjebe Vrijednosti mjerenja ugla zakretanja 5% glukoza 10% glukoza 15% glukoza 20% glukoza 25% glukoza nepoznati uzorak
OVJERA VJEBE
34
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
U pet epruveta staviti nekoliko kapi ulja ili malo masti, a zatim dodati 1-2ml: Hloroforma Acetona Hladnog etanola Zagrijanog etanola Vode Sadraj svake epruvete dobro promukati i zabiljeiti svoja zapaanja o rastvorljivosti lipida.
35
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Emulzifikacija
U tri epruvete staviti nekoliko kapi ulja i malo vode. U prvu eppruvetu dodati 5 kapi 0,5 %-tnog Na2CO3, u drugu 0,5 %-tnog NaHCO3, a u treu nekoliko kapi destilovane vode. Epruvete dobro promukati i ostaviti da stoje neko vrijeme i posmatrati gdje dolazi do stabilizacije emulzije.
Saponifikacija
U epruvetu uzeti 0,5 ml ulja, dodati 10 ml 10%-tne otopine NaOH u etanolu i drati u kljualom kupatilu 5 -10 minuta. Nastaje mlijena emulzija sapuna, na koju se dodaje topla, destilovana voda do otapanja. Podijeliti dobijenu otopinu sapuna na tri epruvete i izvesti slijedee probe.
1. Isoljavanje sapuna
U prvu epruvetu dodati malo vrstog NaCl. Promukati, a zatim dodavati i dalje, sve dok se so rastvara. Stvara se tzv. isoljeni sapun (jer je dodan viak elektrolita).
3. Precipitacija sapuna
U treu epruvetu dodavati kap po kap konc. HCl ili konc. CH3COOH i dobro promukati. Stvara se bijeli talog, jer se zakiseljavanjem, topivi sapun prevodi u netopive masne kiseline.
CH2OH CHOH CH2OH b) Dokazivanje holesterola 1. Salkovskijev (Salkowsky) test na holesterol 200 C CaCl2 bezvodni (veze vodu) CH2 CH akrolein C
O H
U epruvetu staviti 2ml hloroformne otopine holesterola. Paljivo dodati 2ml koncentrovane H 2SO4 i blago promukati. Ostaviti kratko vrijeme i utvrditi da gornji hroloformni dio postaje crven, a donji ut sa zelenom fluorescencijom.
36
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
U epruvetu nasuti oko 2ml hloroformne otopine holesterola, dodati 10 kapi anhidrida acetatne kiseline i 2 kapi konc. H2SO4. Izmjeati staklenim tapiem. Kao pozitivan test javlja se prvo ruiasto, zatim plavo obojenje, koje prelazi u zelenkasto. Holesterol se djelovanje H2SO4 dehidratizira i oksidira. Iz dvije molekule holesterola kondezacijom nastaju ugljikovodici sa dvostrukim vezama koji daju razliite proizvode H2SO4 i acetanhidridom, to je uzrok prelaza boje jedne u drugu boju.
2. Hidroliza lecitina
Staviti u epruvetu 6 ml otopine lecitina, dodati 2-3 ml otopine NaOH i paljivo kuhati 5 minuta. Hidrolizat je potrebno razdijeliti u etiri epruvete.
b) Dokazivanje fosfata
Na 2 ml hidrolozata lecitina dodavati 10 %-tnu HNO3 do neutralizacije. Na neutraliziranu otopinu dodati 2 ml amonijum-molibdata, pri emu nastaje karakteristina uta boja amonijum-fosfomolibdata.
37
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
isplivavaju na povrinu otopine i grade masni, odnosno uljasti sloj. Jaka kiselina HCl istiskuje slabu organsku kiselinu.
3. Dokazivanje glicerola
Dokazuje se na isti nain kao i kod prostih lipida s tim to se uzima suhi ekstrakt lecitina (akroleinska proba).
3. ZADACI I VJEBE
Odgovorite na slijedea pitanja:
1. Napii stukturu linoleinske kiseline? Zato se ova kiselina naziva nezasiena masna kisleina?
5. Koji tip rastvaraa je potreban da bi se otklonila fleka od ulja? Zato? _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ _______________________________________________________________________________ Izvriti eksperimentalni dio vjebe
4. REZULTATI Rastvorljivost
38
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Emulzifikacija
3. Precipitacija sapuna
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
a) Dokazivanje glicerola
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
2. Hidroliza lecitina
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
a) Dokazivanje holina
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ____________________________________________________ _____________________________
b) Dokazivanje fosfata
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
3. Dokazivanje glicerola
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
OVJERA VJEBE:
40
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Odvagati 0.5-1,0 g masti u suhoj erlenmajerovoj tikvici, dodati 50 ml NaOH etanol (c= 0,1 mol/l) i kuhati jedan sat na vodenom kupatilu uz povratno hladilo. Nakon toga smjesa se retitrira sa o,1 mol/l HCl uz indikator fenolftalein. Dobijeni volumen predstavlja volumen HCl koji je utroen na titraciju vika NaOH (koji se nije saponificirao). Pored glavne izvodi se i kontrolna proba koja sadri istu koliinu alkohola i baze koji su dodani pri saponifikacijin (radi utede hemikalija i vremena moe se odmjeriti 10,00 mL o.1 M NaOH i titrirati sa HCl, iji se utroak u tom sluaju mnoi sa 5), a titrira se sa HCl. Utroena koliina HCl odgovara koliini NaOH koja je bila prisutna prije poetka procesa saponifikacije. Iz razlike ove koliine i koliine NaOH koji se nije saponificirao dobije se koliina NaOH koja se saponificirala sa masnim kiselinama u uzorku masti. Ako je raeno sa tano 1 g masti dobijena masa NaOH izraena u miligramima, predstavlja saponifikacijski broj, a ako to nije sluaj preraunati na 1g.
Odvagati 1 g lipida i u digestoru otapati u 30 ml smjese alkohol-eter (1:1) uz blago grijanje na vodenom kupatilu. Nakon to se uzorak otopi, dodati dvije kapi indikatora fenolftaleina u etanolu sa = 0,1 mol/dm3 otopinom KOH do pojave ruiaste boje. Zabiljeiti utroak KOH, a potom blago
41
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
zagrijavati probu na vodenom kupatilu. Ukoliko ruiasta boja nestane, nastaviti titraciju dok boja ne bude stabilna. Za izraunavanje kiselinskog broja (K. Br.) potrebno je odrediti tanu koncentraciju KOH. U tu svrhu sipati 10 ml otopine KOH/etanol u tikvicu, dodati 1-2 kapi indikatora fenolftaleina u etanolu i titrirati sa 0,1000 mol/dm3 otopinom HCl do nestanka ruiaste boje. Zabiljeiti utroak HCl i na osnovu reakcije HCl i KOH izraunati koncentraciju KOH. Nakon toga izraunati K.br. po obrazcu:
K.br. = m(KOH) = c(KOH) x V(KOH) x M(KOH) V(KOH) - volumen KOH utroen za titraciju uzorka lipida 3. ZADACI I VJEBE -Odgovorite na slijedea pitanja: 1. Zato se produkt saponifikacije naziva so?
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
42
laboratorijske vjebe
OVJERA VJEBE:
Vjeba broj 7
43
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Esencijalne koje moramo unositi stalno unositi putem hrane (valin, leucin, izoleucin, metionin, treonin, fenil-alanin, triptofan i lizin) Neesencijalne koje organizam sam sintetizira
Histidin je esencijalna kiselina za pacove, a neki autori ubrajaju i arginin kao esencijalnu kiselinu za ovjeka koja se moe sintetizirati u organizmu, ali sinteza se sporo odvija. Opte osobine aminokiselina Rastvorljivost - Prirodne aminokiseline su kristalne i bezbojne supstance. Sve su osim prolina i oksiprolina rastvorljive u vodi, a ne u alkoholu i drugim organskim rastvaraima. Amfoterne osobine aminokiselina - Zbog toga to imaju amino i karboksilnu grupu tj. baznu i kiselu komponentu tako u baznom podruju pH disociraju karboksilnom, a u kiseloj amino komponentom. Prema tome aminokiseline su amfoterna jedinjenja. Vrijednost izoelektrine take se dobije ako se vrijednosti negativnog logaritma konstante disocijacije kisele (pK1) i bazne grupe (pK2) saberu i podijele sa dva.
Optika aktivnost - Sve prirodne aminokiseline osime glicina, -alanina, -aminobuterne kiseline imaju jedan ili vie asimetrinih C-atoma u molekuli pa su optiki aktivne supstance. Konfiguracija aminokiselina - Sve prirodne aminokiseline imaju lijevu konfiguraciju (L). Reaktivnost aminokiselina - Aminokiseline stupaju u reakcije s itavim nizom jedinjenja, pri emu nastaju derivati, pomou kojih se neke aminokiseline mogu identificirati, a druge se kvantitativno odreuju, a neke od njih se mogu izolirati. Kao amfoterna jedinjenja reaguju sa jakim kiselinama i bazama pri emu nastaju soli. Opta hemijska svojstva su povezana prisutnou karboksilne i aminogrupe, a s druge strane prisutnost reaktivnog R ostatka objanjava specifina svojstva pojedinh aminokiselina.
Reakcije karakteristine na karboksilnog grupi su: Esterifikacija alkoholima u prisustvu jakih kiselina Reakcija dekarboksilacije i nastajanje amina (mogua je hemijskim i enzimskim putem) Stvaranje amida (reakcija aminokisliena sa aminima) Za veinu aminokiselina pK1 1,5 2,5 pK2 9,5 10, 5 pHi 5,5-6,5 Reakcije karakteristine na amino grupi su: Dezaminacija (sa nitratnom kiselinom, uz nastajanje kiseline (alkohola) i oslobaanje nitrogena) Stvaranje imina (kondezacijom sa aromatiskim aldehidima) Reakcije sa fenilizotiocijanatom u baznoj sredini
44
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
45
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Alanin (Ala / A)
Arginin (Arg / R)
Asparagin (Asn / N)
Cistein (Cys / C)
Glutamin (Gln / Q)
Glicin (Gly / G)
Histidin (His / H)
Izoleucin (Ile / I)
Leucin (Leu / L)
Lizin (Lys / K)
Metionin (Met / M)
Fenilalanin (Phe / F)
Prolin (Pro / P)
Serin (Ser / S)
Treonin (Thr / T)
Triptofan (Trp / W)
Tirozin (Tyr / Y)
Valin (Val / V)
Dvije ili vie aminokiselina se mogu meusobno povezati tako da ine amid izmeu -karboksilne skupine jedne aminokiseline i -amino skupine druge aminokiseline. Tu posebnu vrstu veze E. Fischer nazvao je peptidna veza.
46
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Molekule koje sadre dvije amonokiseline povezane peptidnom vezom su dipeptidi, a koje sadre vie aminokiselina meusobno povezanih u lanac peptidnim vezama zovu se tripeptidi, tetrapeptidi, pentapeptidi itd. Peptidi izgraeni od 10 amnikiselina su oligopeptidi, a sa vie od 10 polipeptidi. Peptidi imaju vrlo bitnu bioloku ulogu. Najpoznatiji peptidi su sa jedne strane hormoni (oksitocin, vazopresin, adrenokortikotropni hormon, inzulin), a sa druge antibiotici (penicilin). Imaju ulogu i kao modani neuroprijenosnici kao to je glutation. Molekule biolokog porijekla izgraene uglavnom od aminokiselina meusobno povezanih petidnom vezom u dugake lance zovemo proteini. Za razliku od peptida, proteini imaju karakteristinu viestepenu strukturu. Njenu osnovu predstavlja polipeptidni lanac, u kome su aminokiseline poredane odreenim redom i povezane peptidnim vezama. Ovaj lanac se oznaava kao primarna struktura proteina, a redoslijed aminokiselina u njemu je genetski uslovljen, s obzirom da poziciju jedne aminokiseline u lancu determinira poloaj odgovarajueg tripleta purinskih i pirimidinskih baza u strukturi odgovarajue DNK odgovorne za sintezu dotinog peptidnog lanca. Usljed karakteristika bonih grupa, primarna struktura uslovljava i sve ostale stupnjeve strukture, a to su : sekundarna, tercijarna, kvarterna. Proteini se mogu podijeliti na: Proste (koji predstavljaju polipeptide koji su izgraeni iz velikog broja aminokiselina meusobno povezanih peptidnim vezama) Tu spadaju protamini i histoni, prolamini i glutelini, skleroproteini, albumini i globulini Sloene (pored polipeptidnih lanaca sadre i neku neproteinsku komponentu vazanu za te lance). Tu spadaju hromoproteidi, nukleoproteidi, glikoproteidi i fosfoproteidi. Proteini se dokazuju velikim brojem bojenih reakcija, karakteristinih za funkcionalne grupe i radikale pojedinih aminokiselina. Talone reakcije takoer mogu posluiti za kvalitativno dokazivanje proteina, a neki zahvaljujui tom svojstvu mogu se razdvojiti. Talone reakcije mogu se podijeliti na reverzibilne (sa solima lakih metala i amonijevim solima) i ireverzibilne (sa solima tekih metala, kiselinama i alkaloidnim reagensima). Ireverzibilno taloenje je ustvari denaturisanje proteina.
1. Ninhidrinska reakcija
Napravi se svjea 0,2 %-tna vodena otopina ninhidrina. Zagrijavanjem otopine proteina sa otopinom ninhidrina nastaje plava boja. Ovu reakciju daju proteini koji imaju slobodnu amino grupu i sve amonokiseline.
2. Ksantoproteinska reakcija
Uzmi u epruvetu malo razrijeene otopine proteina (npr. otopina bjelanca jajeta i otopina elatine) i istu koliinu konc. HNO3. Zagrij oprezno do kljuanja i pri tome e nastati uti talog. Na ohlaeni talog dodaj konc. NH4OH, uta boja prelazi u narandastu. Reakcija je pozitivna kod proteina koji u
47
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
sebi sadre aromatske amonokiseline. Reakciju izvesti i sa otopinom triptofana ili tirozina (aromatske aminokiseline) i nekim od alifatskih aminokiselina (alanin, glicin), te uoi razlike.
4. Cisteinska proba
Na 2 ml otopine proteina dodaj 2-3 ml 5 %-tne otopine NaOH i nekoliko kapi 5%-tnog olovnog acetata. Zagrijavanjem nastaje crni talog PbS. Reakcija je pozitivna kod proteina koji sadre aminokiseline sa sumporom. Uraditi reakciju i sa cisteinom (aminokiselina sa sumporom) i nekom od aminokiselina koje ne sadre sumpor, te uoi razliku.
5. Adamkijevieva reakcija
Na 2 ml razrijeene otopine bjelanca jajeta dodaju se 4 ml konc. glacijalne acetatne kiseline i epruveta protrese. Zatim se paljivo dodaje niz zid epruvete, 2 ml konc. H2SO4. Nastaje ljubiasti prsten na nivou kontakta dvije tenosti. Ako se lagano promuka (uz hlaenje), ljubiasta boja difunduje u cijelu otopinu. Reakcija je karakteristivna za triptofan (slobodan ili u sastavu proteina). Zasniva se na reakciji izmeu glioksalne kiseline (sadrane u glacijalnoj acetatnoj kiselini) i triptofana, a nastali spoj ima ljubiasto obojenje kada doe u kontakt sa H2SO4.
2. Ireverzibilno taloenje
Uzmi u epruvetu 2-3 ml otopine proteina, dodaj nekoliko kapi konc. Acetatne kiseline i kap po kap kalijum ferocijanata [K4Fe(CN)6]. Nastaje bijeli talog koji se dodatkom vika reagensa ne otapa.
U tri epruvete nasuti po 2 ml otopine bjelanceta jajeta. U prvu dodati nekoliko kapi acetatnog pufera (pH = 4,7), u drugu 2 kapi konc. HCl, a u treu 2 kapi 10 % NaOH. Lagano zagrijavati i uoiti gdje dolazi do taloenja. Nakon toga u epruvetama gdje nije dolo do taloenja dodati 0,5 ml acetatnog pufera te ponovo zagrijavati. Komentirati uinak pH.
U pet epruveta stavljaju se razliiti omjeri acetatne kiseline (c = 0,2 mol/dm3) i vode i na to dodaje po 0,2 ml otopine kazeina (o,4 % u 0,2 mol/dm3 Na-acetatu). Dodavanjem kazeina u Na-acetatu u epruvete koje sadre razliite omjere acetatne kiseline postie se skala pH od 3,8 do 5,3: Br. epruvete 1 2 3 4 5 ml acetatne kiseline 1,6 0,8 0,4 0,2 0,06 ml vode 0,4 1,2 1,6 1,8 1,94 ml kazeina 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 pH 3,8 4,1 4,4 4,7 5,3
48
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
U svim epruvetama se javlja zamuenje razliitog intenziteta, uz taloenje nakon izvjesnog vremena. U epruveti u kojoj je najvea koliina taloga postignut je pHi, pa treba zabiljeiti tu vrijednost.
3. PRIPREMNA VJEBANJA
1. Za koje spojeve je karakterisitna Ninhidrinska reakcija i prikazati njen mehanizam?
2. Cisteinilalanin (Cys-Ala) je dipeptid sastavljen iz aminokiselina cisteina i alanina. Predloi metodu kojom moe dokazati strukturne sastojke ovog dipeptida? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ 3. Opii primarnu, sekundarnu, tercijarnu i kvarternu strukturu proteina? __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________
1. Ninhidrinska reakcija
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
2. Ksantoproteinska reakcija
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
49
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
3. Biuret reakcija
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
4. Cisteinska proba
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
5. Adamkijevieva proba
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
Talone reakcije
-Reverzibilono taloenje
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
-Ireverzibilno taloenje
__________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________
OVJERA VJEBE:
50
laboratorijske vjebe
Rf = d1/d2
d1 put hromatografirane molekule (cm) 2. EKSPERIMENTALNI DIO
Uzeti 1 g proteina i 15 ml 6 mol/dm3 HCl. Hidroliza se moe vriti u tikvici sa povratnim hladilom ili u staklenoj ampuli koja je uronjena u vodeno kupatilo na navedenoj tmeperaturi ili se moe drati u sunici na toj temperaturi. Prije aplikacije potrebno je hidrolizat proteina upariti na mali volumen. Kao mobilna faza za tankoslojnu hromatografiju aminokiselina slui: hloroform : metanol : 17 % otopina NH3 u volumnom omjeru 40:40:20. Od istih aminokiselina uzeti npr. 0,5 % otopine alanina, triptofana, lizina i leucina (kao standarda).
51
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Na lijevu poziciju startne linije aplizirati po pet kapljica (ne aplicirati narednu kapljicu dok se prethodna ne osui) hidrolizata bjelanceta, zatim standarde aminokiselina, a na desnu poziciju hidrolizat 1%-tnog kazeina. Nakon to se kapljice osue, ploa se stavi u posudu za razvijanje (u kojoj se ve nalazi mobilna faza) pazei da mobilna faza bude barem 1 cm ispod startne linije. Ploa se vadi kada mobilna faza dospije 2 cm prije kraja ploe i ostavi da se osui na sobnoj temperaturi u digestoru. Zatim se ploa prska sa 0,2 % ninhidrinom u acetonu i nakon 2-3 minute ostavi u sunicu na 90 C 10 minuta. Pojavie se razliito obojene mrlje (najee ljubiaste, ali boja moe da bude na prijelazu od narandaste, preko crvene do ljubiaste). Ako se Rf vrijednost obojene mrlje iz uzorka proteinskog hidrolizata poklapa sa Rf vrijednou obojene mrlje standardne aminokiseline moe se rei da je data aminokiselina identificirana u ispravnom uzorku.
4. REZULTATI Hromatografija
d1
d2(mobilna faza)
Rf
52
laboratorijske vjebe
OVJERA VJEBE:
53
laboratorijske vjebe
ENZIMI
1. TEORETSKI DIO
Enzimi su globularni proteini tercijarne ili kvarterne sturkutre koji na povrini imaju veinu polarnih aminokiselinskih ostataka, doku su nepolarni ostaci okrenuti prema unutranjosti molukule. Ovako organizovane proteinske molekule nazvane enzimi imaju visoku kalatitiku mo i specifinost za pojedine hemijske reakcije i supstrate u ivim organizmima. Katalitika mo enzima se manifestira njegovom sposobnou da smanjuje energiju hemijskih reakcija. Enzimi ubrzavaju reakcije i vrlo esto kataliziraju samo jednu hemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija, a specifinost za supstrat je najee potpuna.
U trenutku katalitike promjene supstrat je s enzimom povezan uglavnom slabim nekovalentnim vezama (vodikove, hidrofobne ili Van der Walsove veze) to omoguava brzu izmjenu molekula supstrata na enzimu. Ta izmjena se dogaa u jednom dijelu enzimu nazvanom aktivno mjesto. Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smjetenih u unutranjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekle, ije prostorno ureenje odgovara molekuli supstrata. Taj prostoj u hidrofobnoj unutranjosti je odgovoran za njegovu katalitiku mo. Internacionalnom konvencijom enzim se svrstava u jednu od est vrsta na osnovu hemijske reakcije koju katalizira. Svaka vrsta se dijeli prema prirodi hemijske grupe, koenzima i drugih grupa ukljuenih u reakciju. Saglasno pravilima Evropske komisije (EC), svaki enzim moe se oznaiti jedinstvenim kodom od etiri broja i nedvosmislenim sistemtivnim imenom zasnovanim prema kataliziranoj reakciji. est vrsta enzima su: Oksidoreduktaze, koje prenose atome hidrogena, oksigena ili elektrone od jednog substrata na drugi Transferaze, koje prenose hemijske grupe izmeu substrata Hidrolaze, koje kataliziraju hidrolitike reakcije Liaze, koje razlau substrate reakcijama razliitim od hidrolize Izomeraze, koje pretvaraju izomere jedanu drugi intermolekularnim premjetanjem
54
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Ligaze (sintetaze), koje kataliziraju nastajanje kovalentne veze, sa odgovarajuim cijepanjem nukleozid trifosfata.
Jedinica za enzimsku aktivnost Jedna enzimska jedinica definira se kao koliina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25C, 1 bar), razloi 1 mol supstrata za jednu minutu. Specifina aktivnost enzima moe se izraziti kao broj enzimskih jedinica po miligramu proteina. Nova internacionalna jedinica (IU) odreena od strane EC je katal (kat). Definira se kao koliina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 C, 1 bar) razloi 1 mol supstrata za jednu sekundu. Iz praktinih razloga u upotrebi su manje jedinice kao mikrokatal (kat), pikokatal (pkat), nanokatal (nkat) itd. Amilaza spada u grupu hidrolaza koja se zove karbohidraze, jer kataliziraju hidrolizu oligo- i polisaharida 8sloenih karbohidrata). Hidroliza se vri razlaganjem glukozidnih veza izmeu monosaharida, koji izgrauju oligi- i polisaharide. -amilaza se nalazi u svim organima ovjeka i drugih sisara (ubikvitaran enzim), a najvea aktivnost je u pljuvaki (gdje se nalazi ptijalin) i u pankreasnom soku (gdje se naziva dijastaza). Specifina je za 1-4 glikozidna veza u polisaharidima (krob i glikogen). Poto ne moe da cijepa 1-6 glikozidnu vezu, razlae se oko 80% molekule kroba tj. potpuno hidrolizira amilozu i amilopektin. Krajnji produkti koji nastaju hidrolizom kroba ovim enzimom su maltoza i granini dekstrini koji nastaju na mjestima grananja u amilopektinu, tj. gdje se nalazi 1-6 glikozidna veza. Zato se -amilaza jo naziva i endoamilaza (unutranja) ili,dekstrinogena amilaza. Za razliku od -amilaze, -amilaza je biljnog porijekla. Specifina je, takoe, za 1-4 glikozidnu ezu, ali djeluje na krajevima polisaharidnog lanaca. Zato novi nazivegzoamilaza (spoljanja) i krajni produkti njenog djelovanja su molekule maltoze. Pepsin spada u peptid-hidrolaze, enzime koji kataliziraju hidrolizu proteina i peptida na nie produkte. Hidroliza proteina i peptida se vri razlaganjem peptidnih veza izmeu aminokiselina, koje izgrauju protein odnosno peptide. Pepsin je izrazito aktivan u kiseloj sredini i djeluje na peptidne veze unutar molekula proteina. Aktivan je na prirodne i denaturirane proteine. Ima proteolitiko i laktokoagulirajue djelovanje. Poznato je da pepsin ima i dodatno djelovanje kod odraslih sisavaca, a to je koagulacija mlijeka. Ovu funkciju kod mladih sisavaca vri enzim himozin koji nije zastupljen u eluanom soku odraslih sisavaca. Koagulacija moguava due zadravanje u elucu i samim tim vei proteolitiki efekat pepsina.
Skupiti 2-3ml pljuvake, profiltrirati je, podjeliti na dva dijela. Jedan dio prokljuati na plameniku ili reou. U est epruveta pripremiti smjese prema datoj tabeli: Epruveta krob Lugolov reagens Neprokuhana pljuvaka Prokuhana pljuvaka I 2-3ml II 2-3ml 2-3 kapi Nekoliko kapi III 2-3ml IV 2-3ml 2-3 kapi Nekoliko kapi Nekoliko kapi Nekoliko kapi V 2-3ml VI 2-3ml 2-3 kapi
Svih est epruveta staviti u vodeno kupatilo na 37 C na inkubiranje od 30 minuta. Nakon tog vremena izvaditi epruvete i zakljuiti ta se desilo u epruvetama.
55
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
Izvesti Felingovu reakciju na sadraje u prvoj, treoj i petoj epruveti. U svaku dodati po 1-2ml pripremljenog Felingovog reagensa i zagrijavati do kljuanja. Zakljuiti ta se desilo u ovim epruvetama.
1. Proteolitika aktivnost
U tri epruvete odmjeriti po 1,0 ml 1 % otopine pepsina u 0,5 % otopini HCl. U etvrtu epruvetu odmjeriti 1,0 ml iste otopine pepsina, ali prethodno prokuhanog na 70 - 100 C (u tu svrhu za itavu grupu studenata odmjeriti manju au 10 ml otopine pepsine i prokuhati). Nakon toga dodaj po slijedeoj emi u epruvete: Epruveta 1 dodaj 4 ml destilovane vode Epruveta 2 dodaj 4 ml 0,5% HCl Epruveta 3 dodaj 4 ml 0,5% Na2CO3 Epruveta 4 dodaj 4 ml 0,5% HCl U svaku epruvetu dodati tano 1,00 ml svjeeg, razrijeenog (1:1) bjelanca jajeta, a zatim ih staviti u termostat pri 36,5 C i drati 30 minuta. Nakon toga vizuelno ocjeniti u kojoj epruveti ima najmanje supstrata (bjelanceta), te sve upruvete podvri Biuret testu na slijedei nain: Na 1,00 ml vodene otopine NaOH (6 %) dodati 1,0 ml Biuret reagensa i sadraj protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine uzorka iz epruvete i prmomijeati. Nakon 15 minuta na spektrofotometru izmjeriti apsorbansu pri 545 nm prema slijepoj probi pripremljenoj na slijedei nain: Na 1,0 ml otopine NaOH dodati 1,00 ml Biuret reagensa i sadraj protresti. Na to dodati 0,4 ml otopine pepsina i promijeati. Zabiljeiti izmjerene vrijednosti apsorbanse.
3. PRIPREMNA VJEBANJA
1. Kinetika enzima je rjeena preko Michael-Mentenove konstante. Pronai jednainu i prikai je grafiki?
56
laboratorijske vjebe
Zapaanja
Epruveta
III
Zapaanja
Komentar rezultata 57
Hemija sa stehiometrijom
laboratorijske vjebe
OVJERA VJEBE:
58