Praktikum Fiziologije Bilja

PRAKTIKUM IZ
FIZIOLOGIJE BILJA
Poljoprivredni fakultet u Osijeku, 2009.
Miroslav Lisjak, dipl. inž.

Marija Špoljarević, prof.
Dejan Agić, prof.
dr.sc. Luka Andrić
SADRŽAJ
1. METABOLIZAM BILJAKA
1.1. Određivanje kloroplastnih pigmenata................................................................................. 1.
1.1.A Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije pigmenata po Holmu i Wetstteinu......... 3.
1.1.B Razdvajanje pigmenata kromatografijom na papiru........................................................... 5.
1.2. Određivanje intenziteta fotosinteze kemijskom metodom................................................. 7.
1.3. Mjerenje intenziteta disanja protočnom metodom............................................................. 9.
1.4. Izolacija proteina iz biljnog materijala............................................................................... 12.
1.5. Određivanje koncentracije proteina................................................................................... 14.
1.5.A Određivanje koncentracije proteina Lowry metodom........................................................ 16.
1.6. Sadržaj ukupnih kiselina u voću......................................................................................... 18.
1.7. Određivanje sadržaja reducirajućih šećera u plodovima.................................................... 20.
1.8. Spektroskopsko određivanje ukupnih antocijanina po metodi ekstrakcije uz različit pH.. 22.
2. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA
2.1. Razaranje i analiza elementarnog sastava biljne tvari........................................................ 24.
2.2. Određivanje koncentracije fosfora u suhoj tvari biljaka..................................................... 28.
2.3. Određivanje koncentracije dušika u biljnom materijalu..................................................... 30.
2.4. Određivanje sadržaja nitrata u svježem povrću.................................................................. 32.
2.5. Određivanje aktivnosti nitrat reduktaze.............................................................................. 35.
3. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA
3.1. Život rezanog cvijeća u vazi............................................................................................... 37.
3.2. Mjerenje površine lista........................................................................................................ 40.
3.3. Nastijska gibanja................................................................................................................. 42.
3.3.A Termonastije........................................................................................................................ 43.
3.3.B Fotonastije........................................................................................................................... 44.
3.4. Klijavost i vigor sjemena.................................................................................................... 46.
3.4.A Standardna klijavost i energija klijanja sjemena................................................................. 46.
3.4.B Cold test.............................................................................................................................. 50.
3.4.C Električni konduktivitet sjemena........................................................................................ 52.
3.4.D Zdravstveno stanje sjemena................................................................................................ 54.
3.5. Analiza rasta biljaka............................................................................................................ 57.
3.6. Utvrđivanje alelopatskih odnosa u klijanju......................................................................... 61.
4. FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA
4.1. Određivanje deficita difuznog pritiska (DDP).................................................................... 63.
4.2. Određivanje evapotranspiracije lista................................................................................... 68.
4.3. Određivanje sadržaja prolina.............................................................................................. 70.
4.4. Određivanje sadržaja vitamina C........................................................................................ 72.
4.5. Zaštitno djelovanje šećera pri niskim temperaturama......................................................... 74.
4.6. Aktivnost enzima katalaze.................................................................................................. 76.
1. METABOLIZAM BILJAKA
1.1. ODREĐIVANJE KLOROPLASTNIH PIGMENATA
Uvod u vježbu
Osnovna uloga kloroplastnih pigmenata, posebno klorofila, je apsorpcija svjetlosne energije
koja se zatim procesima fotosinteze transformira u kemijsku energiju. Pigmenti fotoreceptori
su obično obojeni, kompleksni organski spojevi čije se optičke osobine zasnivaju na kemijskoj
strukturi njihovih molekula. Apsorpcija vidljivog dijela spektra, a s tim u vezi i boja
pigmenata, zavisi o prisustvu sistema konjugiranih dvostrukih veza u njihovim molekulama:
-C=C- , -C=N- , -N=N- , -N=O- , -C=S-.
U fotosintetskom aparatu viših biljaka najznačajniji su klorofili i karotenoidi. Dosada poznati

klorofili su -a, -b, -c, -d i -e, a više biljke sadrže klorofil -a (C55H72O5N4Mg) i klorofil -b
(C55H70O6N4Mg) koji se nalaze u tilakoidima kloroplasta (slika 1). Klorofili su esteri
dikarbonske kiseline klorofilina i alkohola fitola. Osnovna građevna jedinica je porfirinski
prsten u čijem je središtu atom Mg vezan na N četiriju pirolovih prstena s dvije kovalentne i
dvije koordinatne veze. Na porfirinsku jezgru vezan je fitolni rep bogat –CH3 skupinama, slika
1. Porfirinska jezgra je hidrofilna a fitolni rep je hidrofoban i lipofilan.
Pri osvjetljavanju klorofila dolazi
do ekscitiranja elektrona i stvaranja
transportnog lanca elektrona kojim
se usvojena svjetlosna energija
prenosi do određenih akceptora
koji dalje omogućuju korištenje te
energije u tamnoj fazi fotosinteze.
Modrozeleni klorofil a i žutozeleni
klorofil b apsorbiraju vidljivi dio
spektra i imaju maksimume
apsorpcije u crvenom (600-700
nm) i plavom (400-500 nm) dijelu
spektra. Njihov kvantitativni odnos
u većine biljaka je otprilike 3:1.
Karotenoidi (provitamini A) su
narančasto-žuti pigmenti koji su po
kemijskoj strukturi derivati
izoprena (8 izoprenskih jedinica), a
mogu biti aciklični, monociklični i Slika 1. Strukturna formula klorofila a i klorofila b;
biciklični. Dijele se na karotene i prostorni izgled klorofila b (gore desno)
ksantofile. Karoteni su žuto-
narančaste boje, a ksantofili imaju kisik u hidroksiketo- ili metoksi- grupi i žute su boje.
Najpoznatiji karoteni su β-karoten (slika 2.) i likopen. Poznati ksantofili su: lutein,
neoksantin, astaksantin, violaksantin i zeaksantin. Uloga im je dvostruka: prijenos energije na
klorofil čime se proširuje spektar apsorpcije svjetlosti i zaštita fotolabilnog fotosintetskog
aparata od oksidativne destrukcije.
1
Slika 2. Strukturna formula β karotena ( preuzeto s
http://www.kii2.ntf.uni-lj.si/e-
kemija/file.php/1/output/barvila3/index.html )
2
1.1.A SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE
PIGMENATA PO HOLMU I WETSTTEINU
Cilj
Odrediti koncentraciju kloroplastnih pigmenata (klorofila a, klorofila b, ukupnih klorofila -a, -
b i karotenoida) u acetonskom ekstraktu biljnog materijala te preračunati koncentracije na
mg/g svježe tvari.
Materijal
pribor i oprema:
vaga, tarionik i tučak, guč br. 3 ili 4, vakuum pumpa na vodeni mlaz, vakuum boca, epruvete
na stalcima, odmjerna tikvica od 25 mL, spektrofotometar, bušač za čepove poznatog
promjera (prema potrebi), žlica, škare, menzura od 10 mL
biljni materijal:
listovi veće površine (0,1 g svježe tvari lista ili narezani listovi odgovarajuće površine)
reagensi:
aceton; magnezijev karbonat (MgCO3); kvarcni pijesak
Način izvođenja vježbe

Postupak ekstrakcije i određivanja pigmenata treba izvoditi brzo, u zamračenim uvjetima ili uz
difuznu svjetlost zbog fotosenzibilnosti pigmenata. Odvaže se uzorak lista mase 0,1 g ili 0,2 g
i prenese u tarionik (mogu se koristiti i kružni isječci poznate površine). Na uzorak se dodaje
oko pola žličice kvarcnog pijeska, malo praha MgCO3 (na vrh noža) radi neutralizacije
kiselosti i 10-ak mL acetona. Smjesa lista i dodanih kemikalija izmacerira se tučkom u
tarioniku, te se macerat kvantitativno prenosi acetonom na guč postavljen na epruvetu
umetnutu u vakuum bocu. Nakon što se macerat profiltrira vakuum pumpom uz ispiranje guča
acetonom, filtrat se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25 mL, koja se nadopunjuje
do oznake acetonom. Spektrofotometrom (slika 3) se očitava transmisija u dobivenom filtratu
na 662, 644 i 440 nm koristeći aceton kao slijepu probu (transmisija (T) = 100).
Slika 3. Spektrofotometar (lijevo); Put kretanja zrake svijetlosti od emisijske lampe preko
zrcala i uzorka do detektora (desno)
3
Očitana transmisija (T) preračunava se u apsorpciju (A) po jednadžbi:
A = 2 - logT
Dobivene vrijednosti apsorpcije (A662, A644 i A440) uvrštavaju se u Holm-Wetstteinove

jednadžbe za izračunavanje koncentracije pigmenata u mg/dm3:
klorofil a = 9,784 × A662 – 0,990 × A644 [mg/dm3]

klorofil b = 21,426 × A644 – 4,65 × A662 [mg/dm3]
klorofil a+b = 5,134 × A662 + 20,436 × A644 [mg/dm3]
karotenoidi = 4,695 × A440 – 0,268 × (klorofil a+b) [mg/dm3]
Brojevi u jednadžbama su molarni apsorpcijski koeficijenti po Holmu i Wetstteinu. Formula

za izračun koncentracije pigmenata na mg/g svježe tvari lista (SvT):
c1 × v × r
c =
m
c [mg/g] - masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po gramu svježe tvari lista
c1 [mg/dm3] - masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po decimetru kubnom
v [mL] - volumen filtrata (tj. odmjerne tikvice) izražen u mililitrima = 25 mL
r - razrjeđenje filtrata
m [mg] - odvaga uzorka izražena u miligramima = 100 mg
Zbog značajnosti koncentracije i odnosa pojedinih pigmenata, računa se odnos klorofila a i

klorofila b, te odnos njihovog zbroja i karotenoida. Vrijednosti treba upisati u tablicu.
Rezultati
Dobivene vrijednosti koncentracije pigmenata i omjeri kl a/b i kl/kar

kl a kl b kl a+b kar kl a/b kl/kar
koncentracija
omjeri
u mg/dm3
pigmenata
koncentracija
u mg/g SvT
4
1.1.B RAZDVAJANJE PIGMENATA KROMATOGRAFIJOM NA PAPIRU
Uvod u vježbu
Metoda odjeljivanja zasnovana na različitoj
distribuciji smjese tvari koju razdvajamo između
mobilne faze (otapala) i neke stacionarne faze fronta
nazivamo kromatografija. Ovisno o dvije faze
između kojih dolazi do raspodjele smjese tvari
koju razdjeljujemo kromatografija može biti na
stupcu, kromatografija na papiru, tankoslojna y
kromatografija, plinska kromatografija…
Kromatografija na papiru zasniva se na razdiobi
x
tvari koju razdjeljujemo (npr. ekstrakt pigmenata)
između otapala kao tekuće mobilne faze (npr.
smjesa petroletera, acetona i n-propanola) i
stacionarne faze krutog adsorbensa (npr. papir). start
Kod ovakve kromatografije otapalo se uspinje Slika 4. Kromatografija na papiru
uz papir zbog kapilarnih sila samog papira,
prenoseći bolje topljive tvari iz smjese dalje od starta. Slabije topljive tvari u smjesi otapalo će
sporije otopiti te samim time i prenijeti kraći dio puta. Teško topive tvari će s otapalom
prevaliti najmanji dio puta. Mjesto na koje nanosimo uzorak naziva se start, a fronta je mjesto
najveće udaljenosti mobilne faze tj. otapala od starta (slika 4). Brzina prolaska tvari po pločici
proporcionalan je prevaljenom putu. O brzini prelaska tvari možemo zaključiti iz omjera
prijeđenog puta tvari od starta (x) i udaljenosti fronte od starta (y); R= x/y.
Cilj
Vizualno određivanje pigmenata na kromatografskom papiru. Izračunati R za svaki pigment
uočen na kromatografskom papiru nakon razvijanja.
Materijal
pribor i oprema:
kromatografski papir Whatman br.1, mikropipeta, fen, kolona za razdvajanje
biljni materijal:
acetonski ekstrakt pigmenata (1 g svježe tvari lista ili 25 mL ekstrakta (vidi u vježbi 1.1.A.))
reagensi:
otapalo-razdvajač (sastoji se od petroletera, acetona i n-propanola u omjeru 90:10:0,45)

Razdvajanje pigmenata izvodi se uzlaznom kromatografskom tehnikom na kromatografskom
papiru pomoću otapala koje služi kao razdvajač pigmenata. Kromatografski papir se izreže u
trake širine 3-5 cm u smjeru valjanja papira. Na donjem kraju trake grafitnom olovkom se
označi startna linija (3 cm od donjeg ruba trake) i startno mjesto (jedno startno mjesto u
sredini startne linije ili dva startna mjesta na istoj liniji s razmakom 2 cm). Na startno mjesto
(ili mjesta) mikropipetom se nanosi 0,1-0,2 mL ekstrakta pigmenata, ali postupno uz sušenje
mrlje fenom tako da mrlja ne bude šira od 10 mm. U kolonu za razdvajanje usipa se otapalo-
razdvajač tako da visina otapala u koloni bude oko 1 cm. Traka kromatografskog papira s
nanešenim ekstraktom uroni se donjim rubom u otapalo, a gornji kraj trake učvrsti se pomoću
čepa i ostavi stajati 15-30 minuta na sobnoj temperaturi. Tijekom navedenog vremena otapalo-
razdvajač se uzdiže po kromatografskoj traci i sobom
5
nosi pigmente koji se razdvajaju i ostaju grupirani na 4
različite razine od dna kolone. Redoslijed pigmenata od karoten
vrha do dna kromatografske trake je slijedeći (slika 5):
1. karoteni – narančaste boje,
2. ksantofili – žute boje,
3. klorofil a – zatvoreno-zelene boje,
4. klorofil b – žuto-zelene boje.
ksantofil
Navedeno razdvajanje pigmenata može se obaviti i na klorofil a

kružnom kromatografskom papiru (φ 150 mm) tako da
se ekstrakt pigmenata nanese u središte papira, a zatim klorofil b
se od ruba do središta kruga izreže traka širine 1 cm
koja će poslužiti za uranjanje u otapalo-razvijač.
Otapalo se usipa u Petrijevu zdjelicu nešto manjeg
promjera od kromatografskog papira, u otapalo se uroni
vrh izrezane trake kružnog papira koji se položi na
Petrijevu zdjelicu i poklopi se s drugom zdjelicom istog
promjera. Nakon razdvajanja pigmenti će opisivati oko
središta papira 4 kružnice (ili elipse) različitih boja.
Najmanja će biti kružnica klorofila b, a najveća linija
kružnica karotena. nanošenja
Potrebno je izračunati R za svaki pojedini pigment
razdijeljen na kromatografskom papiru.
Slika 5. Redoslijed pigmenata
razdvojenih kromatografijom na
papiru
Rezultati
6
1.2. ODREĐIVANJE INTENZITETA FOTOSINTEZE KEMIJSKOM METODOM
Uvod u vježbu
Gledano sa kemijskog aspekta fotosinteza predstavlja niz reakcija oksidacije i redukcije u
kojima se pomoću svjetlosne energije iz niskomolekularnih organskih spojeva (vode i
ugljikovog(IV) oksida) u zelenima biljkama sintetizira organska tvar (ugljikohidrati), iz koje
se kasnijim procesima resinteze sintetiziraju ostali organski spojevi. Pojednostavljeno, reakcija
procesa fotosinteze može se prikazati sljedećom jednadžbom:
svjetlost
nCO2 + nH2O (CH2O)n + nO2
Prema tome, kemijska metoda određivanja intenziteta fotosinteze zasniva se na određivanju

asimilirane količine ugljika u određenom vremenskom intervalu. Metoda se temelji na
razaranju organske tvari biljke jakim oksidansom do CO2 pri čemu je utrošak oksidacijskog
sredstva mjera za određivanje količine ugljika. Razlika u količini ugljika između dva mjerenja
tijekom određenog vremenskog intervala preračunava se u intenzitet fotosinteze izražen u mg
CO2/dm2/h.
Cilj
Određivanje intenziteta fotosinteze analizom asimilirane količine ugljika po lisnoj površini u
jedinici vremena.
Materijal
pribor i oprema:
vaga, 2 Erlenmeyer tikvice od 100 mL, 2 staklena lijevka (φ 6 cm), čaše od 500 mL, bireta,
pipeta od 10 mL, magnetna miješalica, električno kuhalo, kružni bušači
biljni materijal:
biljka u punoj fotosintetskoj aktivnosti
reagensi:
0,067 M kalijev dikromat (K2Cr2O7) u conc. sulfatnu kiselinu (H2SO4); smjesa conc. sulfatne
kiseline (H2SO4) i fosfatna kiselina (H3PO4) u omjeru 1:1; difenilamin indikator; Mohrova sol
(0,1 M FeSO4(NH4)2SO4×6H2O); srebrov(II) sulfat (Ag2SO4)

Izbuše se kružni isječci lista fotosintetski aktivne biljke (4 isječka φ 8-10 mm) i prenesu u
Erlenmeyer tikvicu od 100 mL. Pipetom se dodaje 10 mL 0,067 M K2Cr2O7 i na vrh noža
Ag2SO4. Kao slijepu probu u drugu Erlenmeyer tikvicu bez biljnog materijala dodaje se 10 mL
0,067 M K2Cr2O7 i na vrh noža Ag2SO4. Tikvice se zatvore staklenim lijevcima ili zračnim
hladilom, te istovremeno zagrijavaju sve tikvice s uzorcima (ili slijepom probom) do ključanja
i ostave se da ključaju 5 minuta (istovremeno zagrijavanje neophodno je zbog termičke
nestabilnosti K2Cr2O7). Nakon hlađenja, sadržaj iz tikvica se kvantitativno prenosi u čaše od
500 mL sa 300-350 mL destilirane vode. U svaku čašu dodaje se 2 mL smjese sumporne i
fosforne kiseline, te 10-15 kapi difenilamin indikatora. Potom se titrira sa 0,1 M Mohrovom
soli do prelaska ljubičaste boje u zelenu. Ljubičasta boja obično je vidljiva malo prije točke
ekvivalencije, pa se preporučuje titrirati iznad izvora svjetlosti. Zapiše se utrošak Mohrove soli
u titraciji, ako je utrošak Mohrove soli u titraciji slijepe probe manji od 20 mL, analizu treba
7
ponoviti s manjom količinom organske tvari jer je premalo oksidansa u prethodno izvršenoj
analizi.
Formula za izračun intenziteta fotosinteze:
(a − b) × 0,3×100
[
X mgC/dm2 = ] S
a [mL] - utrošak Mohrove soli za titraciju slijepe probe
b [mL] - utrošak Mohrove soli za titraciju uzorka
0,3 - faktor preračunavanja za odgovarajuću količinu ugljika
100 - faktor za preračunavanje cm2 u dm2
S [cm2] - površina isječaka lista uzetih za analizu
Za preračunavanje rezultata intenziteta u mg CO2/dm2 množi se s faktorom 44/12, što

predstavlja omjer molarne mase CO2 i atomske mase ugljika.
Rezultati
8
1.3. MJERENJE INTENZITETA DISANJA PROTOČNOM METODOM
Uvod u vježbu
Svaka živa, aktivna stanica kontinuirano diše usvajajući kisik i oslobađajući ugljikov(IV)
oksid u jednakim količinama. Disanje se može opisati kao proces oksidacije i redukcije
organske tvari u kojem se supstrat oksidira do ugljikovog(IV) oksida, a kisik reducira do vode
uz oslobađanje kemijske energije. Energija se pohranjuje u energetski bogate spojeve poput
ATP, NADH, NADPH, FADH2 i kao toplinska energija koja se u manjem postotku zadržava u
biljci te stimulira stanične procese a u većem postotku oslobađa u atmosferu ili tlo. Kao
supstrat za disanje može poslužiti škrob, saharoza i drugi šećeri, lipidi, organske kiseline i
iznimno proteini. Uobičajeno disanje u kome se oksidira glukoza predstavlja se jednadžbom:
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2822 kJ
Stoga se protočna metoda mjerenja intenziteta disanja zasniva na određivanju oslobođenog

ugljikovog(IV) oksida u određenom vremenskom intervalu.
Cilj
Utvrđivanje intenziteta disanja analizom oslobođenog CO2 po jedinici mase supstrata u
određenom vremenskom intervalu.
Materijal
pribor i oprema:
vaga, električna vakuum crpka, staklena i gumena crijeva, 3 tikvice od 1000 mL sa čepovima,
Erlenmeyer tikvica od 200 mL, pipeta od 10 mL, titrator
biljni materijal:
klijanci (soje, kukuruza, suncokreta, graha) ili svježa tvar lista
reagensi:
40% natrijev hidroksid (NaOH); 0.5 M kalijev hidroksid (KOH); 100 g uzorka; 0.1 M kloridne
kiseline (HCl); fenolftalein; metiloranž

zrak zrak bez zrak zrak
s CO2 CO2 s CO2 bez CO2
crpka
s CO2
CO2 izdvojen
zrak
disanjem
1. plinska ispiralica komora 2. plinska ispiralica
Slika 6. Shematski prikaz aparature potrebne za pokus mjerenja intenziteta disanja

protočnom metodom
Aparatura potrebna za mjerenje intenziteta disanja spoji se kao što prikazuje slika 6. Potrebno
je utvrditi da li plinska ispiralica s NaOH dobro pročišćava zrak od CO2. Dovodna cijev u obje
plinske ispiralice mora se uroniti u otopinu (40 % NaOH u prvoj, a predložak s 100 mL 0.5 M
9
KOH u drugoj plinskoj ispiralici). Za određivanje intenziteta disanja se u komoru (srednja
posuda) stavi 100 g svježe naklijalog sjemena (ili svježe tvari lista), komora se zamrači ako se
ispituje fotosintetski aktivni dio biljke. Zrak se provlači kroz cijelu aparaturu pomoću
vakuuma kojeg stvara crpka i bilježi se trajanje pokusa (1 sat). Pri tome se odvija slijedeća
reakcija:
2KOH + CO2 → K2CO3 + H2O
Pošto u zraku nema dovoljno CO2 za potpunu neutralizaciju KOH, u predlošku nakon pokusa
preostane i dio KOH. Reakcija neutralizacije je u ekvivalentnim količinama pa je za 10 mL
0.5 M KOH potrebno utrošiti 50 mL 0.1 M HCl. Utrošak HCl za titraciju nakon provedenog
pokusa će biti manji jer je jedan dio KOH neutraliziran vezivanjem CO2. Nastali K2CO3 je
dvobazna sol za čiju neutralizaciju se također utroši određena količina HCl-a pa je postupak
pri titraciji slijedeći:
Odpipetira se 20 mL predloška iz druge plinske ispiralice, dodaje nekoliko kapi indikatora
fenolftaleina (otopina postaje ljubičasta, pH između 8,2 i 9,8) i titrirati s 0,1 M HCl dok se
otopina ne obezboji. Zabilježi se utrošak HCl. Pri opisanoj titraciji se odvija neutralizacija
preostalog KOH a istovremeno prevođenje K2CO3 u KHCO3.
KOH + HCl → KCl + H2O

K2CO3 + HCl → KHCO3 + KCl
Obezbojenom predlošku se doda nekoliko kapi metiloranža, indikacija pH između 3,1 i 4,4;
(otopina postaje narančasto-žuta) i nastavi titracija s HCl do točke neutralizacije (prelazak boje
otopine u ružičastu) te se zabilježi utrošak 0,1 M HCl.
KHCO3 + HCl → KCl + H2O
Formula za izračunavanje disanja:
X[mg CO2/h/kg] = a × 2 × (vp/vt) × 2,2 × (1000/m)
a [mL] - utrošak 0.1 M HCl u drugoj titraciji

2 - utrošak HCl iz druge titracije množi se s 2 jer je to pola reakcije neutralizacije nastalog
K2CO3, pa se ukupna reakcija može prikazati jednadžbom:
K2CO3 + 2HCl → CO2 + H2O + 2KCl
vp[mL] - volumen predloška 0.5 M KOH prije početka pokusa (100mL)

vt[mL] - volumen predloška odpipetiran za titraciju (20 mL)
2,2 - 1 mL 0.1 M HCl veže 2,2 mg CO2

budući da je HCl jednobazna, a H2CO3 dvobazna kiselina, vrijedi:
1 dm3 1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.5 M CO2 = 22 g CO2
1 cm3 (mL) 0.1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.05 mM CO2 = 2.2 mg CO2
1000 – za preračunavanje g u 1 kg
m[g] - početna masa biljne tvari (100 g)
10
Rezultati
11
1.4. IZOLACIJA PROTEINA IZ BILJNOG MATERIJALA
Uvod u vježbu
Pored celuloze proteini čine glavne strukturne polimere biljnih stanica i tkiva. Unatoč velikoj
raznovrsnosti količina proteina u biljnim tkivima relativno je niska, što predstavlja dodatni
izazov pri njihovoj izolaciji. Pojam izolacije obuhvaća sve radnje kojima se koristimo
prigodom prevođenja proteina iz njihova prirodnog okružja u otopinu.
Kemijske metode kojima se uobičajeno koristimo za izolaciju organskih tvari ne mogu se
primijeniti pri izolaciji proteina jer su oni osjetljivi na toplinu, kiseline, lužine, organska
otapala i zračenje. Iako je era proteomike donijela veća poboljšanja u pogledu primjene
tehnika i metoda u izolaciji proteina, još nije moguće preporučiti jedinstvenu metodu kojom
bi se izvršila izolacija svih proteina. Prigodom izbora metode za izolaciju proteina iz biljnog
tkiva susrećemo se s određenim problemima koje svakako moramo uzeti u obzir, a neki su od
njih navedeni u daljnjem tekstu.
Biljne stanice sadrže krutu staničnu stjenku pa je prvi korak u izolaciji razbijanje biljnog
materijala radi izdvajanja staničnog sadržaja. To se uglavnom postiže mehaničkim
postupcima kojima se biljno tkivo usitnjava korištenjem različitih miksera, mješača ili rezača.
Čest je postupak da se svježe biljno tkivo prelije tekućim dušikom i usitni trenjem u tarioniku.
Pri usitnjavanju i homogeniziranju uzorka također se može upotrijebiti kvarcni pijesak ili
drugo abrazivno sredstvo. Kako se pri mehaničkom razbijanju uzorka razvija toplina,
cjelokupan se postupak uglavnom izvodi pri temperaturama između 0 i +4°C kako bi se
spriječila denaturacija proteina.
Sljedeći postupak u izolaciji jest ekstrakcija proteina usitnjenog uzorka korištenjem pogodnog
ekstrakcijskog pufera. Pri izboru pufera treba obratiti posebnu pozornost na vrstu proteina i
svrhu zbog koje se izolacija vrši (npr. određivanje koncentracije proteina, pročišćavanje
proteina i sl.). Dobar ekstrakcijski pufer trebao bi također biti primjenjiv s obzirom na
različitu prisutnost velikog broja sekundarnih staničnih metabolita kako između biljnih tkiva
(list, stabljika, korijen, sjeme i plod) tako i između različitih biljnih vrsta.
Općenito se za pripremu sirovog ekstrakta biljnih proteina može upotrijebiti fosfatni ili Tris
pufer određene pH vrijednosti i ionske jakosti. Zbog prisutnosti uglavnom serinskih proteaza
u uzorku biljnoga tkiva, puferu se dodaje fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF) koji inhibira
njihovu aktivnost, čime se sprječava razgradnja proteina. Dodatak polivinilpolipirolidona
(PVPP) ekstrakcijskom puferu također se često koristi za sprječavanje interakcije velikog
broja fenolnih i polifenolnih spojeva s proteinima i time štiti njihova nativna struktura.
U posljednjem koraku izolacije proteina, homogenat se najčešće centrifugira radi odvajanja
netopljivih dijelova stanica od otopine. Supernatant dobiven centrifugiranjem predstavlja
sirovi ekstrakt proteina i služi za daljnju analizu i obradu.
Cilj
Upoznati se s biokemijskim metodama izolacije proteina. Prirediti sirovi ekstrakt proteina iz
biljnog materijala.
12
Materijal
pribor i oprema:
vaga, tarionik, posuda s ledom, stakleni lijevak, pipeta od 5 mL, škare, analitička vaga kiveta
za centrifugiranje, centrifuga, biljni materijal, kvarcni pijesak
biljni materijal:
list biljke
reagensi:
PBS pufer (Phosphate buffer saline): priređuje se otapanjem 800 mg NaCl, 20 mg KCl, 140
mg Na2HPO4 i 24 mg KH2PO4 u 0,1 L dH2O. Prije upotrebe podesiti puferu pH vrijednost na
7,4.

Priprema sirovog ekstrakta biljnih proteina:
Odvagati 2 g biljnog materijala, škarama ga usitniti na manje komade i prenijeti u tarionik
(hlađen na ledu). Usitnjeni materijal homogenizirati u tarioniku uz dodatak kvarcnoga pijeska
i 2 mL hladnoga ekstrakcijskog pufera (pufer dodavati u 3 porcije, a zadnjom isprati tarionik).
Ovako pripremljen homogenat kvantitativno preliti u praznu kivetu za centrifugiranje i
centrifugirati pri 5.000xg, 15 minuta na 4°C. Dobiveni supernatant (sirovi ekstrakt) pažljivo
dekantirati u čistu epruvetu i koristiti za određivanje koncentracije proteina Lowry metodom.
*PBS (Phosphate buffer saline)
Pitanja
1. U koje svrhe koristimo izolaciju proteina ?
2. Kada je važno izolaciju proteina obavljati pri niskim temperaturama ?
3. Koja je uloga ekstrakcijskog pufera pri izolaciji proteina ?
4. O čemu ovisi izbor pH vrijednost ekstrakcijskog pufera ?
5. Kako bi ste u nedostatku centrifuge odvojili netopivi dio homogenata od otopine ?
13
1.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA
Uvod u vježbu
Postoji više metoda i postupaka za određivanje koncentracije proteina, a izbor metode može
ovisiti o vrsti materijala i količini uzorka te koncentraciji proteina u uzorku. Najčešće
korištene metode za određivanje koncentracije proteina u sirovom nepročišćenom ekstraktu
jesu Biuret metoda, Lowry metoda i Bradford metoda. Određivanje koncentracije proteina
ovim metodama temelji se na vezanju specifičnoga bojenog reagensa na molekulu proteina.
Pritom dolazi do pomaka apsorpcijskoga maksimuma boje vezanog reagensa u odnosu na
apsorpcijski maksimum boje nevezanog reagensa. Intenzitet nastale boje pod određenim
uvjetima slijedi Lambert-Beerov zakon te je proporcionalan koncentraciji proteina. Kod
navedenih kolorimetrijskih metoda koncentracija proteina ovisna je o broju i sastavu
aminokiselina, te ovakva mjerenja zahtijevaju primjenu standarda. Kao standard koristi se
protein koji je po sastavu jednak ili sličan proteinu koji se analizira.
Biuret metoda:
Ovom se metodom prvenstveno dokazuje prisutnost peptidne veze. Naziv je dobila po
kondenzacijskom produktu dviju molekula uree - biuretu, koji također daje pozitivnu
reakciju. Metoda se temelji na osobini peptidne veze da u alkalnoj otopini tvori kompleks s
ionima Cu2+, slika 7. Nastali je kompleks ljubičaste
boje s apsorpcijskim maksimumom pri 540 nm.
Osim što je točna i vrlo ponovljiva, glavna je
prednost ove metode u tome što je manje osjetljiva
na vrstu proteina koji se određuje. Metoda je
prikladna za analizu otopina proteina u
koncentracijama između 1,0 i 10 mg/mL .
Lowry metoda:
Metoda kombinira reakciju bakrovih iona s
peptidnim vezama u alkalnoj otopini (Biuret
metoda) i reakciju redukcije Folin-Ciocalteau
reagensa (smjesa molibdata i volframata) s
fenolnom skupinom tirozina i triptofana dajuću Slika 7. Kompleks peptidnih veza
plavo-ljubičasto obojenje. Koncentracija se proteina i iona Cu2+
određuje pri valnoj duljini od 750 nm, kada se
postiže maksimum apsorpcije reduciranog oblika Folin-Ciocalteau reagensa. Ova je metoda
osjetljivija u odnosu na prethodnu, a prikladna je za određivanje proteina u koncentracijama
između 0,01 i 1,0 mg/mL.
Bradford metoda:
Ova se metoda često koristi zbog jednostavne priprema reagensa, brzog razvijanja boje i
niskoga praga osjetljivosti. Pokazala se osobito praktičnom prigodom određivanja
koncentracije proteina u sadržaju određene stanične frakcije kao i pri procjeni količine
proteina potrebne za gel elektroforezu. Metoda se temelji na pomaku apsorpcijskoga
maksimuma slobodne boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (slika 8) valne duljine 465 nm na
595 nm prilikom njezina vezanja na protein. Donji prag osjetljivosti ove metode iznosi 0,5
µg/mL proteina.
14
Slika 8. Strukturna formula Coomassie Brilliant Blue G-250
15
1.5.A ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA LOWRY METODOM
Cilj
Upoznati se s kolorimetrijskom metodom određivanja koncentracije proteina Lowry metodom,
načinom izrade i uporabom baždarnoga dijagrama.
Prirediti standardni niz otopina, izraditi baždarni dijagram i odrediti koncentraciju proteina.
Materijal
pribor i oprema:
7 odmjernih tikvica od 100 mL, 8 epruveta, pipete od 1, 5, 10 i 20 mL, stakleni lijevak,
kolorimetar ili spektrofotometar
biljni materijal:
list biljke
reagensi:
Reagens A: 2% Na2CO3 u 0,1 mol/L NaOH;
Reagens B: 0,5% CuSO4 x 5H2O u 1% K Na-tartaratu 1 ;
Alkalni reagens : priprema se miješanjem 50 mL reagensa A s 1mL reagensa B 2;
Folin-Ciocalteu reagens : kupovni reagens razrijediti destiliranom vodom u omjeru 1:1;
Standardna otopina albumina goveđeg seruma (BSA) koncentracije 0,2 mg/mL;
Sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala (razrijeđen s dH2O u omjeru 1:100)

Potrebno je pripremiti sedam odmjernih tikvica od 100 mL i označiti ih: S0, S5, S10, S20, S40,
S60 i S100. Za pripremu razrjeđenja standardne otopine BSA potrebno je odpipetirati količine
navedene u tablici 1.
Tablica 1. Priprema standarda otopine BSA
Oznaka odmjerne tikvice → So S5 S10 S20 S40 S60 S100

mL BSA (0,2 mg mL-1) 0 5 10 20 40 60 100
mL dH2O 100 95 90 40 60 40 0
Koncentracija BSA mg mL-1
Potrebno je izračunati koncentracije BSA u svakom pojedinom standardu i podatke upisati u

posljednji red tablice.
Za pripremu standardnog niza priprema se osam čistih epruveta te ih se označi: S0, S5, S10, S20,
S40, S60, S100 i U. Iz svake odmjerne tikvice (oznaka S0, S5, S10, S20, S40, S60 i S100), pipetira se
po 1 mL otopine i dodaje u pripadnu epruvetu (oznaka S0, S5, S10, S20, S40, S60 i S100).
Usporedno s pripremom standardnog niza, iz odmjerne tikvice uzorka pipetira se 1 mL
otopine i dodaje u praznu epruvetu s oznakom U. U svaku epruvetu potom dodaje se 5 mL
alkalnog reagensa, sadržaj se promućka i smjesa ostavi 15 minuta na sobnoj temperaturi.
Nakon 15 minuta u svaku epruvetu dodaje se 0,5 mL Folin-Ciocalteau reagensa, smjesa se
dobro promućka i ostavi 15 min. na sobnoj temperaturi kako bi se razvila boja 3. Nakon
razvijanja boje na kolorimetru (uz korištenje crvenog filtra) ili spektrofotometru (λ 750 nm)
očitava se vrijednost apsorbancije za sadržaj svake epruvete standardnog niza i uzorka. Za
baždarenje uređaja upotrjebljava se slijepa proba (epruveta s oznakom S0).
16
Rezultati
Na osnovi dobivenih vrijednosti apsorbancije uzoraka standardnog niza i poznatih
koncentracija BSA izraditi baždarni dijagram s pravcem. Vrijednost ekstinkcije uzorka
(epruvetu s oznakom U) ucrtati na koordinatu baždarnoga dijagrama te preko baždarnoga
pravca očitati koncentraciju proteina u uzorku. Izračunati ukupnu količinu proteina u biljnom
ekstraktu i rezultat izraziti u mg proteina po gramu svježega biljnog materijala.
Pitanja:
1. Na temelju kojeg zakona se vrši kolorimetrijsko određivanje koncentracije proteina ?
2. Zašto kolorimetrijsko mjerenje koncentracije proteina zahtjeva upotrebu standarda ?
3. Što je standardni niz ?
4. Zašto se u našem slučaju sirovi ekstrakt razrjeđuje prije mjerenja koncentracije
proteina ?
5. Što bi ste učinili sa sirovim ekstraktom ukoliko ima nisku (kolorimetrijski nemjerljivu)
koncentraciju proteina ?
1
Pripremiti svježu otopinu reagensa B
2
Otopinu alkalnog reagensa pripremiti neposredno prije pipetiranja.
3
Kiseli Folin-Ciocalteau reagens je nestabilan u jako lužnatoj otopini (alkalni reagens)
te se mora brzo dodati i dobro promućkati.
17
1.6. SADRŽAJ UKUPNIH KISELINA U VOĆU
Uvod u vježbu
U pokazatelje kakvoće voća (plodova) ubraja se i ukupan sadržaj kiselina. Kiselost voćnih
plodova čine organske kiseline kao što su limunska ili jabučna. One se nalaze u voćnom soku
kao slobodne ili u obliku soli. Određivanje kiselosti se vrši titracijom s otopinom NaOH, uz
fenolftalein kao indikator.
Cilj
Utvrditi sadržaj ukupnih kiselina u plodu voća.
Materijal
pribor i oprema:
pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom, mikser ili sl.) 1 Erlenmeyerova (EM)
tikvica s brušenim grlom od 250 mL, 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s neubrušenim grlom od
250 mL, 1 odmjerna tikvica od 250 mL, stakleni lijevak za filtriranje, filter-papir, bireta ili
titrator, vodena kupelj, magnetna miješalica i stirer, povratno hladilo, pipeta od 25 – 100 mL,
menzura do 250 mL, odmjerne tikvice od 250 mL, vaga
biljni materijal:
uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke, jagode, grožđe i dr.)
reagensi:
0,1 M otopina natrijavog hidroksida (NaOH) poznatog faktora (točne koncentracije),
fenolftalein

Odvagati 25 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu s brušenim grlom od
250 mL, dodati 150 mL destilirane vode. Sadržaj miješati na magnetnoj miješalici dok
tekućina ne bude homogena. Tikvicu spojiti s povratnim hladilom i zagrijavati na vodenoj
kupelji 30 min. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 250 mL, te nadopuniti
s dest. vodom do oznake i promućkati. Filtrirati kroz naborani filter-papir u EM tikvicu od 250
mL. Ovisno o očekivanoj kiselosti odpipetirati 25 - 100 mL u odgovarajuću EM tikvicu i
titrirati s 0,1 M NaOH poznatog faktora, uz fenolftalein kao indikator, do pojave svijetlo
ružičaste boje u trajanju od najmanje 30 sek. Volumen NaOH utrošenog za titraciju se
zabilježi, te se izračuna sadržaj ukupnih kiselina.
Ukupne kiseline (kiselost, mmol/100 g ploda) = (250/m) * V1 * C * (100/V0)
V0 [mL] - volumen uzorka

V1 [mL] - volumen NaOH utrošen za titraciju
C [mol/L] - točna koncentracija otopine NaOH
m [g]- odvagana masa ploda za analizu
18
Rezultati
Literatura
Generalić, I., Skroza, D., Katalinić, V. (2009.): Skripta za vježbe iz kolegija: Kemija mediteranskog voća i
tehnologija prerade. Zavod za prehrambenu tehnologiju i biotehnologiju, Kemijsko-tehnološki fakultet
Sveučilišta u Splitu. Str. 45.
19
1.7. ODREĐIVANJE SADRŽAJA REDUCIRAJUĆIH ŠEĆERA U PLODOVIMA
Uvod u vježbu
Saharoza je disaharid čijom hidrolizom (inverzijom) nastaje jedna molekula glukoze i jedna
molekula fruktoze, koje se zajedničkim imenom nazivaju invertni šećeri. Saharoza u svojoj
molekuli nema slobodnu aldehidnu grupu, te kao takva ne može reducirati Fehlingovu
otopinu, na čemu se zasniva metoda određivanja šećera. Reducirajući šećeri su svi šećeri, koji
imaju keto ili aldehidnu funkcionalne skupine, kao što su glukoza i fruktoza te pentoze.
Cilj
Utvrditi sadržaj reducirajućih šećera u plodu voća.
Materijal
pribor i oprema:
pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom, mikser ili sl.), vodena kupelj,
magnetna miješalica i stirer, kuhalo, bireta ili titrator, vaga, odmjerne tikvice 200 mL, 3
Erlenmeyerove (EM) tikvice od 250, 300 i 500 mL, povratno hladilo, stakleni lijevak,
naborani filter-papir, odgovarajuće pipete, vaga, staklene kuglice
biljni materijal:
uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke, jagode, grožđe i dr.)
reagensi:
3 M otopina sulfatne kiseline (H2SO4); 0,1 i 1 M otopina natrijevog hidroksida (NaOH); 0,1 M
otopina kloridne kiseline (HCl); Luffov reagens, otopine Carrez I i Carrez II; 0,1 M otopina
natrijeva tiosulfata (Na2S2O3); 0,1% otopina škroba; 30% otopina kalijevog jodida (KJ); 30%
otopina fenolftaleina; kalcijev karbonat (CaCO3)

Odvagati 10 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu od 250 mL, dodati
100 mL destilirane vode, promiješati i grijati na vodenoj kupelji 10 -15 min. Ohlađeno
kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 200 mL, dodati 1-2 g CaCO3, 5 mL Carrez I i 5
mL Carrez II, nadopuniti s dH2O do oznake i promućkati. Ostaviti da se istaloži nakon čega
filtrirati u suhu EM tikvicu od 300 mL. U EM tikvicu od 500 mL odpipetirati 25 mL Luffove
otopine, 10 mL prethodno dobivenog filtrata uzorka i 15 mL dest. vode. Dodati staklene
kuglice i zagrijavati direktno na plamenu do vrenja, nakon čega kuhati 10 min uz povratno
hladilo, na azbestnoj mrežici. Ohladiti pod vodenim mlazom, dodati 10 mL otopine KJ i
oprezno 25 mL otopine H2SO4. Nakon toga titrirati s Na2S2O3 dok boja ne postane žuta.
Dodati nekoliko mL otopine škroba i nastaviti titraciju do potpunog nestanka plave boje.
Paralelno treba raditi slijepu probu, s 25 mL dest. vode umjesto filtrata iz plodova uzetih za
analizu. Volumen Na2S2O3 utrošenog za titraciju zabilježiti, te izračunati sadržaj reducirajućih
šećera.
Sadržaj reducirajućih šećera (prirodnog inverta) = X * 100 / mg uzorka u alikvotu
X [mg] - miligrami prirodnog inverta, očitani iz tablice 2, prema razlici utroška Na2S2O3
između slijepe probe i uzorka
mg uzorka u alikvotu - 500 (ako se izvaže 10 g uzorka i razrijedi na 200 mL otopine te se
uzme 10 ml alikvota)
20
Rezultati
Tablica 2. Vrijednosti prema Luff-Schoorlovom reagensu:

0,1 mol/l Glukoza, fruktoza, invertni šećeri
(Na2S2O3) C6H12O6
ml
(X)mg razlika
1 2,4
2 4,8 2,4
3 7,2 2,4
4 9,7 2,5
5 12,2 2,5
6 14,7 2,5
7 17,2 2,5
8 19,8 2,6
9 22,4 2,6
10 25,0 2,6
11 27,6 2,6
12 30,3 2,7
13 33,0 2,7
14 35,7 2,7
15 38,5 2,8
16 41,3 2,8
17 44,2 2,9
18 47,1 2,9
19 50,0 2,9
20 53,0 3,0
21 56,0 3,0
22 59,1 3,1
23 62,2 3,1
Literatura
http://www.mps.hr/pdf/zakoni/Pravilnik_o_seceru_i_ostalim_saharidima_njihovim_otopinama_te_skrobu_i_skro
bnim_sirupima_NN_174_04.doc
21
1.8. SPEKTROSKOPSKO ODREĐIVANJE UKUPNIH ANTOCIJANINA PO
METODI EKSTRAKCIJE UZ RAZLIČIT pH
Uvod u vježbu
Crveno-ljubičasta boja biljnog tkiva (listovi, plodovi, peteljke, latice, korijen) kod različitih
vrsta voća, povrća, cvijeća i ratarskih usjeva potječe uglavnom od grupe vodotopljivih
flavonoidnih spojeva antocijanina, akumuliranih u vakuolama stanica, slika 9.
Slika 9. Specifično antocijansko obojenje listova, plodova i latica različitih biljnih vrsta
Svojstvo obojenosti u velikoj mjeri utječe na prihvatljivost biljnih proizvoda od strane
potrošača i njihovu tržišnu vrijednost. Također, potencijalna zdravstveno-promotivna svojstva
antocijanina poput zaštite od slobodnih radikala, dakle njihova antioksidacijska svojstva, čine
ih sve interesantnijim biljnim funkcionalnim komponentama. Akumulacija antocijanina u
vegetativnim dijelovima biljaka je često pokazatelj reakcije biljke na stres uvjetovan
okolišnim činiteljima, poput nedostatka dušika i fosfora. Sinteza antocijanina u biljkama
polazi od fenilalanina te je poznato više od 550 antocijanina (2006. godina). Analiza sastava
antocijanina nije moguća bez HPLC i MS tehnike, dok se njihov ukupan sadržaj može odrediti
spektrofotometrijski na 510 nm te izraziti kao mg cijanidin-3-glukozid klorida u kg svježe
mase biljnog tkiva. Metoda se temelji na strukturalnoj razlici antocijanina pri različitoj pH
vrijednosti medija (pri pH 1,0 su obojeni, pri pH 4,5 bezbojni), uslijed čega pokazuju različitu
apsorpciju svjetlosti valne duljine 510 nm.
22
Materijal
pribor i oprema:
vaga, tekući dušik s priborom za maceraciju (keramički tarionik s tučkom), vortex, centrifuga
s hlađenjem, spektrofotometar sa staklenim kivetama, analitička vaga, odgovarajuće pipete i
odmjerne tikvice, plastične epruvete od 15 mL s čepom
biljni materijal:
uzorci svježeg ili zamrznutog biljnog tkiva (list, latice, plod i dr.)
reagensi:
pufer I: pH 1,0 (10 mL po uzorku; 125 mL 0,2 M KCl i 375 mL 0,2 M HCl);
pufer II: pH 4,5 (10 mL po uzorku; 400 mL 1 M CH3COONa, 240 mL 1 M HCl i 360 ml
deionizirane H2O)

Nekoliko grama biljnog tkiva (3-5 g) se tekućim dušikom macerira do finog praha, nakon čega
se odmah odvaže po 0,5 g u posebno označene dvije plastične epruvete od 15 mL. U jednu se
dodaje 10 mL pufera I a u drugu isti volumen pufera II. Nakon homogenizacije vorteksiranjem
(10-tak sekundi), obje suspenzije se centrifugiraju dva puta po 15 minuta na 5000 G pri 4oC.
Supernatanti se koriste za mjerenje apsorpcije na 510 nm, koristeći čiste pufere kao slijepe
probe.
Formula za izračun ukupnog sadržaja antocijanina:
ANT (mg/kg svježe mase) = (ApH 1,0 - ApH 4,5) x (484,8/24 825) x 20 000
ANT[mg/kg] - sadržaj antocijanina u mg po kg svježe mase biljnog tkiva

ApH 1,0 – apsorpcija u uzorku s puferom I
ApH 4,5 – apsorpcija u uzorku s puferom II
484,8 – molekularna masa cijanidin-3-glukozid klorida
24 825 – molarni apsorpcijski koeficijent cijanidin-3-glukozid klorida
20 000 – faktor za preračunavanje na mg/kg svježe mase
Rezultati
Literatura
Lee, J., Durst, R.W., Wrolstad, R.E., Barnes, K.W., Eisele, T., Giusti, M.M., Haché, J., Hofsommer, H., Koswig,
S., Krueger, D.A., Kupina, S., Martin, S.K., Martinsen, B.K., Miller, T.C., Paquette, F., Ryabkova, A., Skrede,
G., Trenn, U., Wightman, J.D. (2005): Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit
juices, beverages, natural colorants, and wines by the pH differential method: Collaborative study. Journal of
AOAC International, Vol. 88(5): 1269-1278.
R. Lo Scalzo, A. Genna, F. Branca, M. Chedin and H. Chassaigne (2008): Anthocyanin composition of

cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) and cabbage (B. oleracea L. var. capitata) and its stability in
relation to thermal treatments. Food Chemistry, Vol. 107(1): 136-144.
23
2. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA
2.1. RAZARANJE I ANALIZA ELEMENTARNOG SASTAVA BILJNE TVARI
Uvod u vježbu
Mineralne tvari (biogeni mineralni elementi: P, K, Ca, Mg, S, Fe, Cu, Zn, Mn, B...) čine mali
dio ukupne suhe tvari biljke, svega oko 3%. Stupaju u različite fiziološke procese poput
osmoregulacije, aktivacije pojedinih enzima, biološke katalize, prenošenje elektrona… Zbog
toga su vrlo velikog fiziološkog i praktičnog značenja za biljku. Temelj kemijske analize
mineralnog sastava biljne tvari čini priprema osnovne otopine uzorka (oksidacijom biljne tvari
razaranjem ili spaljivanjem) i određivanja koncentracije elemenata u osnovnoj otopini. Zbog
različitih koncentracija može se posebno pripremati osnovna otopina za analizu različitih
elemenata (mikroelementi: Fe, Zn, Mn, Cu… i toksični elementi: Hg, Pb, Cd, As… kojih ima
u vrlo malim količinama s obzirom na zastupljenost mineralnih makroelemenata: P, K, Ca…).
Postoji više različitih načina razaranja biljne tvari, koji se primjenjuju ovisno o elementima
koje će biti analizirani, vrsti biljnog materijala i dostupnosti opreme.
Cilj
Odrediti sadržaj mineralnih elemenata biljne ishrane.
Materijal
pribor i oprema:
vaga, kivete za razaranje (staklene za razaranje na bloku, teflonske za razaranje u mikrovalnoj
peći), stakleni lijevci, odmjerne tikvice od 100 ili 50 mL, filter-papir, 2 staklene pipete od 25
mL i propipeta (za razaranje na bloku), automatska pipeta od 10 mL (za razaranje u
mikrovalnoj peći), boca špricalica, plastične bočice od 100 mL
biljni materijal:
osušeni samljeveni uzorak biljne tvari bilo kojeg dijela biljke
reagensi:
za suho spaljivanje: conc. nitratna kiselina (HNO3); ekstrakcijska smjesa (0.05 M HCl + 0.05
M H2SO4)
za mokro spaljivanje na bloku: conc. vodikov peroksid (H2O2), smjesa za razaranje (4%
HClO4 u H2SO4)
za razaranje u mikrovalnoj peći: conc. vodikov peroksid (H2O2), conc. nitratna kiselina
(HNO3)
24
Način izvođenja vježbi
Suho spaljivanje:
1.0 g suhe biljne tvari zagrijava se 4 sata na
500°C u peći za žarenje (slika 10), te se
ohladi. U odmjernu tikvicu se doda 1 mL
conc. HNO3, zatim se u istu tikvicu
ekstrakcijskom smjesom (0.05 M HCl +
0.05 M H2SO4) prenosi pepeo i istom
smjesom dopuni do 100 mL.
Mokro spaljivanje:
Na 1.0 g suhe biljne tvari doda se 5 mL
conc. HNO3 i 2 mL conc. H2SO4 te se
zagrijava iznad plamenika do prestanka
stvaranja bijele pare. Ohlađeni uzorak se u
odmjernoj tikvici nadopuni do 100 mL Slika 10. Peć za žarenje
smjesom kiselina (0.05 M HCl + 0.05 M
H2SO4).
Mokro spaljivanje (II. metoda):

Na 1 do 2 g suhe biljne tvari doda se 5 mL smjese
za razaranje (4% HClO4 u H2SO4). Nakon toga
uzorak se prelije sa 10 mL conc. H2O2 i stavi na
blok za razaranje. Uzorak sa smjesom kiselina i
vodikovim peroksidom se zagrijava na bloku za
razaranje (slika 11) pri temperaturi od 340-360°C
oko sat vremena (ovisno o vrsti razaranog biljnog
materijala) do gubitka boje i potpunog
razbistravanja. Ako uzorak nakon razaranja bude i
dalje mutan prema potrebi se dodaje od 5-10 mL
vodikovog peroksida i razara još dodatnih 20-30
min. Ohlađeni uzorak se kvantitativno prenosi u
odmjernu tikvicu od 25, 50 ili 100 mL ispirući Slika 11. Blok za razaranje
deioniziranom vodom te se nadopuni istom
vodom do oznake.
Prilikom suhog spaljivanja mogućnost kontaminacije uzorka je veća kao i stvaranje teže
topivih oksida željeza i mangana tijekom žarenja, stoga valja dati prednost metodi mokrog
spaljivanja. Ako se iz matične otopine žele daljnjim analizama odrediti elementi u tragovima
ili teški metali tada je prikladnije raditi po metodi razaranja mikrovalovima, jer se neki
elementi, poput selena, prilikom razaranja na bloku gube isparavanjem već pri temperaturama
od oko 200°C.
25
Razaranje mikrovalovima:
U teflonske kivete odvaže se 1 g
suhe biljne tvari, te prelije sa 8-10
mL koncentrirane HNO3 i 2-4 mL
koncentriranog H2O2. Kivete se
hermetički zatvore i umetnu u za njih
predviđeno kružno postolje koje se
postavi u mikrovalnu peć (slika 12).
Biljni materijal se razara pod tlakom
od 180 psi u trajanju od 20 min.
Ohlađeni uzorak se kvantitativno uz
ispiranje deioniziranom vodom
prelijeva u odmjerne tikvice od 25,
50 ili 100 mL i nadopuni vodom
(dH2O) do oznake.
Slika 12. Mikrovalna peć za razaranje
Određivanje koncentracije mineralnih elemenata AAS-om i ICPS-om:

Koncentracije mineralnih elemenata u osnovnoj otopini određuju se apsorpcijskom i/ili
emisijskom tehnikom pomoću AAS-a (atomskog apsorpcijskog spektrofotometra; slika 13) ili
emisijskom tehnikom pomoću ICPS-a (plazme; slika 14). Za mjerenje je potrebno pripremiti
koncentracijski niz standardnih otopina poznatih koncentracija elemenata koje želimo
analizirati, te njima kalibrirati AAS ili ICPS. Rezultati koje očitavamo s AAS-a ili ICPS-a
izraženi su u µg/mL ili mg/L (prijašnje oznake ppm) i označavaju koncentraciju ispitivanog
elementa u osnovnoj otopini. Očitane vrijednosti koncentracije analiziranih elemenata nakon
mjerenja, preračunavaju se u koncentraciju elemenata u µg/g ili g/kg suhe tvari biljke.
Slika 13. AAS analizator - atomski Slika 14. ICPS analizator – plazma
adsorpcijski spektrofotometar
26
Formula za izračunavanje koncentracije mineralnih elemenata u analiziranom uzorku biljne
tvari:
c∗v
X [µg / g ] =
m
X[µg/g] - koncentracija ispitivanog elementa u uzorku suhe tvari biljke

c [µg/mL] - masena koncentracija ispitivane otopine uzorka (očitanje s AAS-a)
v [mL]- volumen osnovne otopine
m [g] - odvaga suhe tvari biljke za analizu
Rezultati
27
2.2. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FOSFORA U SUHOJ TVARI BILJAKA
Uvod u vježbu
Biljke usvajaju fosfor iz tla najvećim dijelom kao jednovalentni fosfatni anion (H2PO4 -;
dihidrogen fosfat) ili dvovalentni anion (HPO4 2-; hidrogen fosfat). Za razliku od dušika i
sumpora, fosfor ne podliježe redukciji u biljkama već ostaje u obliku fosfata u slobodnom
obliku ili organski vezan u esterima. Fosfat je lako pokretljiv u biljnom organizmu, esencijalan
je dio fosfatiziranih šećera koji sudjeluju kao metaboliti u procesima fotosinteze, disanja i
drugih metaboličkih procesa, u sastavu je nukleotida koji čine DNA i RNA te fosfolipida u
sastavu biomembrana. Nezamjenjiva uloga ovog makroelementa je u brojnim
transformacijama tvari i energije u stanici, gdje sudjeluje u obliku spojeva bogatih energijom
poput ATP i sl.
Određivanje koncentracije fosfora se u načelu vrši spektrofotometrijski, na temelju specifične
apsorpcije svjetlosti (725 nm) u plavo obojenom fosfor-molibdatskom kompleksu.
Cilj
Odrediti koncentraciju fosfora u suhoj tvari biljnog materijala, prethodno razorenog uz pomoć
smjese kiselina i vodikovog peroksida.
Materijal
pribor:
spektrofotometar sa staklenim kivetama, odmjerne tikvice od 100 mL, odgovarajuće pipete (1-
10, 5 i 10 mL)
biljni materijal:
suha tvar biljaka (nadzemni dijelovi ili korijen) dobivena sušenjem na 105oC ili matična
otopina uzorka biljne tvari razorena mokrim postupkom (pogledaj vježbu 2.1.)
reagensi:
5% amonijev molibdat (5 g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O se otopi u 80 mL destilirane vode, doda 2,8
mL koncentrirane sulfatne kiseline i dopuni do 100 mL destiliranom vodom); 11% natrij sulfit
(Na2SO3); 0,5% hidrokinon; osnovni standard za fosfor (0,4394 g KH2PO4 se otopi u 1 L
destilirane vode.

Priredi se serija standardnih otopina poznate koncentracije fosfora tako da se u odmjerne
tikvice od 100 mL prenese 0, 1, 2, 3, 4, 5 i 6 mL osnovnog standarda (koncentracija 0 - 6 µg
P/mL). Od matične otopine uzorka u kojem se određuje koncentracija fosfora pipetom se
prenese 10 mL u odmjernu tikvicu od 100 mL. U sve tikvice (standardi i uzorci) doda se oko
50 mL destilirane vode, 5 mL amonijevog molibdata, po 1 mL natrijevog sulfita i hidrokinona
i dopuni destiliranom vodom do 100 mL. Tikvice se začepe i promućkaju te ostave da se
razvije boja tijekom 1 h u mraku. Nakon toga se spektrofotometrom mjeri apsorpcija na 725
nm te pomoću kalibracijskog dijagrama ili kompjuterskog programa za izračun koncentracije
na temelju serije standarda, izračuna koncentracija fosfora u µg/mL otopine, odnosno
preračunavanjem na odvagu suhe tvari uzorka uzetu za dobivanje matične otopine, u % na
suhu tvar analiziranog biljnog materijala.
28
Postotak fosfora treba prema sljedećoj jednadžbi:
%P =
(c * (100
v
)) *10 −2
m
c [µg/mL] - koncentracija P
v [mL] - alikvot matične otopine (10 mL)
m [g] - odvaga suhe tvari uzorka u 100 mL matične otopine
Rezultati
29
2.3. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE DUŠIKA U BILJNOM MATERIJALU
Uvod u vježbu
Aparat za određivanje
koncentracije (slika 15)
dušika sastoji se od dvije
međusobno povezane
jedinice: destilacijske
jedinice i titratora.
F
Određivanje koncentracije
dušika temelji se na
istiskivanju dušika u obliku
amonijaka (NH3) iz uzorka
jakom bazom u predložak sa
kiselinom poznate
koncentracije i pH
A B C D E G
vrijednosti.
Natrijev hidroksid istikuje
dušik iz uzorka u obliku
amonijaka (NH3), u
plinovitom stanju. Slika 15. Aparatura za određivanje sadržaja dušika.
Prolazom kroz hladilo A) 30% NaOH; B) deH2O; C) 2% H3BO3; D) kiveta sa
plinoviti oblik amonijaka uzorkom; E) predložak; F) hladilo; G) titrator sa pH
prelazi u tekući, te kaplje u sondom
predložnu čašicu u kojoj se
nalazi borna kiselina. U reakciji borne kiseline i amonijaka nastaje njihova kompleksna sol, a
pH vrijednost raste. pH vrijednost ne smije porasti preko 7 jer bi se u protivnom amonijak
gubio isparavanjem. Generiranjem vodene pare, uzorak ključa otprilike 4-5 min. te titrator
počinje sa titracijom otopine u predlošku s 0,25 M sulfatnom kiselinom (H2SO4). Sulfatna
kiselina je jaka kiselina koja istiskuje borne anione iz kompleksne soli amonijaka i borata, te
nastaje sol amonij sulfat ((NH4)2SO4). Ovom reakcijom hidronijevi ioni borne kiseline postaju
ponovo slobodni u otopini predloška i svojom aktivnošću spuštaju pH vrijednost do 4,6
(početna pH vrijednost borne kiseline). Vrijednost postotka dušika određuje se prema utrošku
kiseline za titraciju po formuli koja je unesena u memoriju titratora.
Cilj
Odrediti postotak dušika u matičnoj otopini razorenog biljnog tkiva.
Materijal
pribor
destilacijska jedinica, titrator sa pH metrom, automatska pipeta od 10 mL, tips
reagensi
matična otopina prethodno razorenog biljnog tkiva; 30% natrijav hidroksid (NaOH); 2% borna
kiselina (H3BO3) pH 4,6 ; 0,25M sulfatna kiselina (H2SO4)

Potrebno je pripremiti matičnu otopinu razorenog biljnog tkiva kojeg želimo upotrijebiti kao
uzorak za određivanje koncentracije dušika (vidi vježbu 2.1.). Destilacijska jedinica i titrator
se uključe, te otvori voda za hlađenje. Sonda titratora za mjerenje pH uroni se u spremnik sa
30
2%-tnom bornom kiselinom i izmjeri se pH vrijednost. Ako pH vrijednost odstupa od 4,6
potrebno ju je podići ili spustiti dodavanjem 1M NaOH ili 1M HCl automatskom pipetom u
spremnik s bornom kiselinom. Nakon toga pH sonda se uranja u predložnu čašicu. U kivetu za
uzorak odpipetira se 10 mL matične otopine, te se ona pažljivo postavi u nosač na aparaturi za
destilaciju. Na destilacijskoj jedinici pritisne se tipka start a na upravljaču jedinice za titraciju
tipka MEAS/HOLD/8, sada se na zaslonu titratora mogu pratiti promjene pH vrijednosti.
Nakon završetka titracije potrebno je zabilježiti volumen utrošene 0,25 M H2SO4 .
Postotak dušika u uzorku računa se po formuli:
7 * V * (100
v
) *10−2
%N =
m
V [mL] - volumen utrošene 0,25 M H2SO4 za titraciju otopine iz predloška do pH 4,6

v [mL] - alikvot matične otopine (10 mL)
m [g] - odvaga suhe tvari uzorka u 100 mL matične otopine
7 - faktor za preračunavanje količine vezanog N na 0,25M H2SO4 (1mL 0,25 M H2SO4 veže 7
mg N)
Postotak dušika pomnožen s 5,7 (za pšenicu) ili s 6,25 (u prosjeku) daje približnu
koncentraciju sirovih proteina.
Rezultati
31
2.4. ODREĐIVANJE SADRŽAJA NITRATA U SVJEŽEM POVRĆU
Uvod u vježbu
Sadržaj nitrata (NO3-) i nitrita (NO2-) u poljoprivrednim proizvodima je značajan pokazatelj
kvaliteta proizvoda, koji može posredno utjecati na zdravlje ljudi. Prehranom čovjek unese
više nitrata nego nitrita ali se djelovanjem bakterija u probavnom sustavu nitrati reduciraju u
nitrite. Nitriti su štetniji za zdravlja čovjeka od nitrata. Prekomjerna razina nitrita u organizmu
može izazvati methemoglobinemiju, bolest u kojem hemoglobin prelazi u methemoglobin koji
ne može vezati kisik i time ga prenositi u tkiva te time može rezultirati smrću. Drugi problem
prekomjerne razine nitrita u organizmu je što u reakciji s sekundarnim i tercijarnim aminima u
kiselom mediju želuca nastaju kancerogeni nitrozamini. Glavni izvor unosa nitrata u
organizam predstavljaju pitka voda i namirnice biljnog porijekla, a u manjim količinama mogu
se pronaći u suhomesnatim proizvodima. Nitiriti se putem povrća i voća unose u manjim
količinama, iznimka su oštećeno povrće, loše uskladišteno ili uskladišteno na duže vrijeme,
ukiseljeno i fermentirano povrće. Prema odredbama FAO i WHO od 2002. godine potvrđen je
dozvoljeni dnevni unos nitrata u organizam odraslog čovjeka te iznosi do 3.7 mg/kg/danu što
je ekvivalent 222 mg/danu za čovjeka teškog 60 kg a nitrita do 0.07 mg/kg/danu. U dnevni
unos treba računati nitrate u hrani i u vodi. Sadržaj nitrata u pitkoj vodi od strane WHO
ograničen je na 50 mg/L.
Akumulacija nitrata u biljci je posljedica prekomjernog usvajanja nitrata iz tla ili neadekvatne
redukcije u biljci (redukcija do amonijaka i sinteza aminokiselina). Naročito je primijećena
intenzivna akumulacija nitrata u lisnatom povrću, koje se često konzumira svježe, bez
termičke obrade. Povrće poput salate, špinata, kelja i celera se smatra pravim „akumulatorima
dušika“. U području umjerene klime gdje se povrće uzgaja u uvjetima niskog intenziteta
svjetlosti razina nitrata u biljci može biti povećana jer je proces redukcije nitrata u nitrite u
biljci povezan s procesom fotosinteze.
Špinat posijan zimi a ubran ljeti
(naročito u vrijeme sušnog perioda)
sadrži više nitrata od špinata posijanog
ljeti koji se ubire tijekom jeseni i zime.
Na obiteljskim gospodarstvima često
se prekomjerno gnoji mineralnim ili
organskim gnojivima koja u svom
sastavu sadrže dušik, kao i prilikom
uzgoja povrća u staklenicima, a to
može rezultirati višim sadržajem
nitrata u povrću i voću od dozvoljenog.
Kontrola sadržaja nitrata u biljnim
proizvodima sustavno se provodi u
razvijenim zemljama svijeta, te postoje
utvrđene smjernice za nadzor kvaliteta Slika 16. Reflectoquant® nitratni test i testne trake
poljoprivrednih proizvoda u EU.
Najjednostavnija analitička metoda za utvrđivanje sadržaja nitrata u biljnom materijalu je
određivanje pomoću Reflectoquant® nitratnog testa i testnih trakica za nitrate, slika 16. Testne
trakice imaju dvije reakcijske zone koje sadrže reagense za redukciju nitrata do nitrita i
reakciju nitrita s Griess-ovim reagensom. U reakciji nitrata s reagensima testne trakice nitrati
se reduciraju u nitrite a oni reagiraju s Griess-ovim reagensom gdje kao produkt nastaje azo-
spoj crvenkaste boje određenog intenziteta. Intenzitet boje razmjeran je početnoj koncentraciji
nitrata, koju instrument određuje kolorimetrijski.
32
Cilj
Odrediti koncentraciju nitrata u otopini nitrata pomoću instrumenta Reflectoquant.
Materijal
pribor i oprema:
odmjerna tikvica, laboratorijska čaša od 100 mL, Reflectoquant instrument, testne trakice za
mjerenje nitrata, stakleni lijevak, Erlenmeyerova tikvica od 250 mL, grijače tijelo - električni
rešo, lonac, vodena kupelj, filter-papir, vaga, tučak i tarionik
biljni materijal:
krumpir ili neki drugi biljni materijal naveden u tablici
reagensi:
otopina nitrata, deionizirana voda

Potrebno je homogenizirati oko 0,5 kg povrća. U skladu s tablicom 3 se odvaže određena
količina homogeniziranog biljnog materijala te se kvantitativno prenese u Erlenmeyerovu
tikvicu od 250 mL uz dodatak destilirane vode ili deionizirane vode prema zapisu u tablici 1.
Tikvica s biljnim materijalom se petnaest minuta zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji. Na
otvor tikvice treba staviti mali stakleni lijevak ili zračno hladilo kako bi se pare kondenzirale i
slijevale nazad u tikvicu. Ohlađeni uzorak se filtrira kroz naborani filter-papir u odmjernu
tikvicu odgovarajućeg volumena i dopuni deioniziranom vodom. Dio filtrata se presipa u čistu
i suhu laboratorijsku čašu.
Tablica 3. Odnosi volumena vode i biljnog materijala pri pripravi otopine za mjerenje nitrata
instrumentom Reflectoquant
Vrsta povrća Odvaga Dodatak vode Konačni volumen Faktor

[g] [mL] [mL]
brokula 10 50 100 10
salata endivija 10 50 100 10
salata glavatica 5 50 100 20
krastavac 10 50 100 10
mrkva 10 40 50 5
paprika 25 20 25 1
radič 10 50 100 5
rajčica 25 40 50 2
kupus 10 40 50 5
krumpir 10 40 50 5
Prije mjerenja koncentracije nitrata potrebno je kalibrirati instrument Reflectoquant.

Kada je instrument kalibriran treba pritisnuti tipku START i istovremeno uroniti testnu traku u
filtrat u laboratorijskoj čaši. Nakon 2 sekunde testna traka se izvadi iz filtrata a višak tekućine
se odstrani povlačeći traku preko ruba čaše. Nakon isteka 55 sekundi, od trenutka pritiska
tipke START, instrument daje zvučni signal tada je potrebno uložiti traku na odgovarajuće
mjesto u aparat. Zvučni signal se čuje 5 sekundi nakon kojih aparat mjeri koncentraciju nitrata.
Na digitalnom zaslonu automatski se pojavljuje vrijednost koncentracije nitrata u mg/L
filtrata. Dobivenu vrijednost potrebno je pomnožiti s faktorom preračunavanja iz tablice 3.
kako bi dobili vrijednosti nitrata u mg/kg biljne mase.
33
Rezultati
Sadržaj nitrata u ______________________________ je ________________________.
34
2.5. ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI NITRAT REDUKTAZE
Uvod u vježbu
Nitrat reduktaza je enzim koji katalizira redukciju nitratnog oblika dušika. Biljke dušik
usvajaju tijekom cijele vegetacije , kao NO3- i NH4+ iz tla. Ovi anorganski (mineralni) oblici
dušika se razlikuju po svom fiziološkom djelovanju. Nitratni oblik nije toksičan za stanicu te
se može nakupljati u vakuoli, ali da bi se mogao iskoristiti za sintezu dušičnih organskih
spojeva, mora se reducirati do amonijačnog oblika. Usvojeni amonijačni oblik se ne može
nakupljati u biljci jer djeluje toksično te se direktno ugrađuje u organsku tvar, najčešće
aminacijom organskih kiselina pri čemu nastaju aminokiseline i slijedi sinteza proteina.
Redukcija nitrata odvija se u više stupnjeva od kojih je prvi redukcija do nitrita NO2- , koju
katalizira nitrat reduktaza u korijenu ili nadzemnim dijelovima biljke i to u citoplazmi. Zatim
slijedi daljnja redukcija u kloroplastima (nitrit reduktaza). Proces nitratne redukcije zahtijeva
visok utrošak energije jer se oksidacijski broj dušika mijenja od +5 do –3. Visoka aktivnost
ovog enzima javlja se u mladom lišću i može poslužiti za prognozu prinosa i utvrđivanju
potrebe za prihranom dušikom.
Cilj
Određivanje aktivnosti enzima nitrat reduktaze u svježem uzorku lišća.
Materijal
pribor i oprema:
epruvete, termostat, pipete, odmjerne tikvice od 25 mL, spektrofotometar
biljni materijal:
svježi uzorak lišća
reagensi:
inkubacijski medij (otopine kalij dihidrogenfosfat i nitrat, n-propanol u omjeru 3:0,8:1,2),
sulfanilna kiselina; α-naftilen amid; natrij nitrat

10 cm2 lisne površine ili 1 g svježe mase lista se potopi u epruvetu s 10 mL inkubacijskog
medija i stavi na inkubaciju u termostat na 36oC oko 30-60 min. Nakon inkubacije epruveta s
uzorkom se izvadi iz termostata, doda se 3 mL otopine sulfanilne kiseline za blokiranje
djelovanja enzima i 2 mL α-naftilen amida koji s nastalim nitritima stvara kompleks ružičaste
boje. Intenzitet boje ovisi o koncentraciji nitrita u otopini pa se ona utvrđuje
spektrofotometrijski na 536 nm uz seriju standardnih otopina poznate koncentracije. Pomoću
njihove koncentracije i očitanja na skali spektrofotometra konstruira se kalibracijski dijagram
na kojem se očitava nepoznata koncentracija nitrita u uzorku.
Dobivena vrijednost koncentracije nitrita u µg NO2/mL otopine množi se s koeficijentom 15
zbog preračunavanja na ukupni volumen otopine u epruveti s uzorkom lista i preračuna na 24
h, ovisno o trajanju inkubacije.
35
Konačna aktivnost enzima izražava se kao koncentracija nastalog NO2 po gramu svježe tvari u
24 sata.
µg NO2/g/24 h]= c(NO2)*15*24

X[µ
X[µg NO2/g/24 h] - aktivnost nitrat reduktaze

c(NO2) [µg NO2/mL] - koncentracija NO2
15 - koeficijent za preračunavanje na razrjeđenje od 15 mL (ukupni volumen otopine u
epruveti)
24 - koeficijent za preračunavanje na 24 sata (ako je inkubacija trajala 1 sat)
Rezultati
U svježem uzorku aktivnost nitrat reduktaze je __________________________________
________________________________________________________________________
36
3. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA
3.1. ŽIVOT REZANOG CVIJEĆA U VAZI
Uvod u vježbu
Rezano cvijeće ima određene karakteristike koje su važne uzgajivačima i trgovcima.
Karakteristike poput boje, oblika, veličine i mirisa određene vrste cvijeća određuju vizualni i
mirisni dojam cvijeta. Osim navedenih karakteristika dobro je znati koliki je vremenski period
života cvijeta od trenutka njegova ubiranja do trenutka njegova venuća. Vremenski period
života cvijeta može se produžiti pravilnim rukovanjem i smanjivanjem mogućih stresnih
uvjeta nakon branja, tijekom transporta i prilikom skladištenja. Fiziološki procesi unutar
cvijeta utječu na njegovu dugovječnost. Temperatura i dobra opskrbljenost vodom su vanjski
čimbenici koje možemo kontrolirati a koji utječu na fiziološke procese cvijeta. Povišenjem
temperature utječemo na intenzitet transpiracije i brzinu otvaranja pupova ali smanjujemo
život rezanog cvijeća u vazi.
Cilj
Utvrditi utjecaj vanjskih čimbenika na duljinu života rezanog cvijeća te odrediti vremenski
period otvaranja pupova od trenutka njihova ubiranja do njihova venuća.
Materijal
pribor i oprema:
škare za obrezivanje, plastična posuda napunjena vodom iz slavine, traka za izoliranje ili
samoljepljivi papirići, flomaster, staklenke s probušenim poklopcem na pet mjesta, ljepljiva
traka i škare za papir, menzura od 500 mL, laboratorijska čaša od 250 mL, pomična mjerka ili
ravnalo, papirnati ručnici, komora za klijanje biljaka
biljni materijal:
rezani vrhovi cvjetovi ruže određene sorte
Prilikom odabira cvjetova potrebno je odabrati jednako razvijene pupoljke koje nakon rezanja
treba uroniti u vodu i što prije transportirati u laboratorij. Za ovu vježbu dobro je koristiti
cvijeće koje ima krupan i zrakasto simetričan cvijet koji ne raste u cvatovima (ruže, karanfili,
tulipani, gerberi, božuri, hibiskusi, dalije itd.).
reagensi:
vodovodna voda

Staklenke napuniti s 500 mL vodovodne vode.
Obilježiti cvjetove trakom za izoliranje ili
samoljepljivim papirićima te flomasterom napisati
oznake od 1 do 15 K (kontrolirani uvjeti) i od 1 do
15 N (nekontrolirani uvjeti). Kroz poklopac svake
staklenke provući 5 stabljika tako da prilikom
stavljanja u staklenku dodiruju dno a lišće ispod
poklopca potrebno je ukloniti. Kako bi se spriječio
ulazak mjehurića zraka u ksilem škarama za
obrezivanje treba odrezati oko 1 cm od reza na
stabljici. Mjehurići zraka bi onemogućili apsorpciju Slika 17. Postavljeni pokus
37
i daljnji transport vode u biljci što bi uzrokovalo venuće biljnog materijala. Stabljike odrezati
ispod površine vode u posudi napunjenom vodom iz slavine. Biljni materijal sa poklopcem
premjestiti u staklenku s odmjerenim volumenom vode i staklenku dobro zatvoriti. Pukotine
između poklopca i stabljike kroz koje bi mogla
isparavati voda te mjesto navoja staklenke i
poklopca dobro oblijepiti ljepljivom trakom (slika
17).
Pomičnom mjerkom ili ravnalom izmjeriti najveći i
najmanji promjer pupoljka cvijeta a rezultate
zabilježiti kao srednju vrijednost minimalnog i
maksimalnog promjera pupoljka (slika 18).
Tri ponavljanja (repeticije) odnosno tri staklenke u
kojima se nalaze cvjetovi obilježeni od 1 do 15 K
staviti u komoru za klijanje biljaka u vremenskom
periodu od tjedan dana pri kontroliranim uvjetima Slika18. Mjerenje promjera
(na temperaturu od cvijeta
15°C, bez svjetla).
Tri ponavljanja obilježena oznakama od 1 do 15 N ostaviti
tijekom tjedan dana pri sobnim nekontroliranim uvjetima gdje
temperatura oscilira a jačina i trajanje osvjetljenja variraju.
Nakon tjedan dana izmjeriti i izračunati srednju vrijednost
promjera svih cvjetova koji su sada značajnije većeg promjera.
Potrebno je donijeti zaključak usporedbom rezultata dobivenih
prilikom samog postavljanja vježbe i rezultata dobivenih
nakon određenog vremenskog perioda.
Tijekom tjedan dana biljke su nastavile proces transpiracije te
se volumen vode iz staklenke smanjio. Kako bi se odredio
intenzitet transpiracije potrebno je izmjeriti volumen vode koji
je preostao u staklenci nakon određenog vremenskog perioda
te izračunati koliki volumen vode je utrošilo 5 cvjetova
Slika 19. Gerberi u vazi procesom transpiracije.
nakon nekoliko dana
izloženi nekontroliranim
uvjetima
Intenzitet transpiracije = VU – V1
VU [mL] - ukupni volumen H2O

V1[mL] - volumen H2O nakon određenog vremena
Usporedbom rezultata može se donijeti zaključak o intenzitetu transpiracije pri kontroliranim

i nekontroliranim uvjetima.
Ako se pokus ostavi duže od tjedan dana potrebno je promatrati promjene na cvjetovima do
početka smanjivanja promjera cvjetova zbog venuća ocvijeća ili do vremena venuća cvjetne
stapke prilikom kojeg se ona savije (slika19.). Prema potrebi treba dodati vodu u staklenke a
količinu dodanog volumena zabilježiti i zbrojiti s prethodnim ukupnim volumenom.
38
Rezultati
Promjer cvijeta Volumen vode
Ø1 [cm] Ø2 [cm] Ø2 – Ø1 [cm] V1 [mL] V2 [mL] VT [mL]
1. N
2. N
3. N
4. N
5. N
6. N
7. N
8. N
9. N
10. N
11. N
12. N
13. N
14. N
15. N
Promjer cvijeta Volumen vode

Ø1 [cm] Ø2 [cm] Ø2 – Ø1 [cm] V1 [mL] V2 [mL] VT [mL]
1. K
2. K
3. K
4. K
5. K
6. K
7. K
8. K
9. K
10. K
11. K
12. K
13. K
14. K
15. K
Ø1 [cm] – početni promjer pupa (cm)

Ø2 [cm] – promjer cvijeta nakon određenog vremenskog perioda (cm)
V1 [mL] – početni volumen vode u staklenci (mL)
V2 [mL] – izmjereni volumen vode nakon određenog vremenskog perioda (mL)
VT [mL] – volumen vode utrošen u procesom transpiracije (mL)
39
3.2. MJERENJE POVRŠINE LISTA
Uvod u vježbu
Dovoljna količina vode u biljci osigurava normalne fiziološke procese a time i njen kvalitetan
rast i razvoj. Biljka vodu iz zemLje preuzima korijenom pomoću procesa transpiracije i
korijenovog tlaka koji provode vodu kroz ksilem prema nadzemnim organima biljke.
Transpiracijom biljka izlučuje vodu u obliku vodene pare sa površine nadzemnih organa te
time čini najveću pokretačku silu protoka vode. Lišće biljke su najznačajniji transpiracijski
organi o čijoj površini ovisi i količina transpirirane vode. O ukupnoj površini biomase lišća
ovisi i proces fotosinteze.
Cilj
Utvrditi površinu lisne biomase biljnog materijala.
Materijal
pribor i oprema:
vaga, metar, škare, nekoliko papira A4 formata, olovka
biljni materijal:
listovi ruže ili gerbera (može i neki drugi biljni materijal)
reagensi:
vodovodna voda

Papir A4 formata potrebno je izvagati, izmjeriti njegovu dužinu i širinu te izračunati njegovu
površinu.
P [cm2] = a * b
Sa jedne biljke se odvoje svi listovi pazeći da ostanu cjeloviti. Važno je obratiti pažnju na
anatomske karakteristike lista jer listovi mogu biti jednostavni, sastavljeni i razdijeljeni. Svi
listovi se poslože na izvagani papir za koji nam je poznata površina. Svaki list se obcrta prema
rubovima što vjerodostojnije. Ako svi listovi jedne biljke nisu stali na jedan papir ostatak
listova stavi se na novi papir poznate mase i površine. Izrežu se likovi lišća s papira. Treba
paziti da se ne pomiješaju likovi koji su bili nacrtani na jednom papiru s likovima koji su bili
nacrtani na drugom papiru. Likovi lišća s prvog papira se izvažu te se izračuna njihova
površina.
P L [cm2] = P P * m L / m P
P L – površina lista
P P – površina papira
m L – masa lista
m P – masa papira
Izrezani likovi s drugog papira se izvažu i izračuna se njihova površina. Površine likova
listova s jednog i drugog papira se zbroje.
40
Rezultati
Ovu tablicu treba upotpuniti rezultatima dobivenim iz biljnog materijala korištenog u vježbi „Život
rezanog cvijeća u vazi“.
Površina Ukupno Srednja Površina lista Ukupno Srednja
lista [cm2] [cm2] vrijednost [cm2] [cm2] vrijednost
[cm2] [cm2]
1. N 1. K
2. N 2. K
3. N 3. K
4. N 4. K
5. N 5. K
6. N 6. K
7. N 7. K
8. N 8. K
9. N 9. K
10. N 10. K
11. N 11. K
12. N 12. K
13. N 13. K
14. N 14. K
15. N 15. K
N – biljke postavljene u nekontroliranim uvjetima

K – biljke postavljene u kontroliranim uvjetima
Problemski zadaci
1. U sedam dana biljka koja ima lisnu površinu od 5 dm2 transpiracijom izgubi 250 mL
vode. Izračunaj koliko će vode biljka transpirirati preko površine lista od 1 dm2?
41
3.3. NASTIJSKA GIBANJA
Uvod u vježbu
Nastijska gibanja ili nastije su gibanja biljnih organa određena njihovom građom a pokrenuta
podražajem iz okoline koji biljci služi samo kao signal. Ako su nastije uvjetovane promjenama
temperature zovemo ih termonastije, ako su uvjetovane promjenama intenziteta svjetlosti
zovemo ih fotonastije (slika 20). Poznate su još i kemonastije kod kojih su gibanja uvjetovana
kemijskim podražajem, seizmonastije kod kojih su gibanja uzrokovana mehaničkim
podražajima, tigmonastije kod kojih su gibanja uvjetovana trenjem biljke o čvrstu podlogu itd.
Nastijska gibanja rjeđe su rezultat nejednolikog rasta suprotnih strana organa a češće
promjenama turgora koje su reverzibilne. Termonastije su uočljive kod cvjetova mnogih
biljaka koji se otvaraju tijekom dana kada je temperatura zraka povišena a zatvaraju se kada je
temperatura zraka snižena. Šafrani i tulipani listove ocvjećja mogu otvarati i zatvarati i
nekoliko puta tijekom dana ovisno o temperaturnim prilikama a promjene se kod njih očituju
već nakon nekoliko minuta. Različite biljne vrste različito su osjetljive na promjene
temperature npr. cvjetovi tulipana reagiraju na razliku u temperaturi od 1 - 3°C a cvjetovi
šafrana reagiraju na razliku u temperaturi već od 0,2 - 0,5°C. Gibanje listova ocvjećja moguće
je uočiti i prilikom promjena u intenzitetu osvjetljenja. Većina biljnih vrsta otvara cvjetove ili
listove prilikom jačeg intenziteta svjetlosti a zatvara prilikom slabijeg. Neke biljne vrste se
očituju i obrnutim gibanjem svojih organa u odnosu na intenzitet svjetlosti.
Slika 20. fotonastijska gibanja listova kiselice (Oxalis acetosella)

(slike preuzete: http://bitkiselumit.blogcu.com/eksi-yoncanin-faydalari_30376161.html )
42
3.3.A TERMONASTIJE
Cilj
Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na temperaturu kao vanjski faktor
utjecaja.
Materijal
pribor i oprema:
vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom, pomična mjerka, komora za klijanje cvijeća, hladnjak
biljni materijal:
cvjetovi tulipana (Tulipa sp.), cvjetovi šafrana (Crocus sp.)
reagensi:
vodovodna voda

Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s
vodom. Kako bi promatrali termonastije nekoliko biljaka treba staviti u prostoriju u kojoj je
temperatura zraka oko 20°C, a nekoliko biljaka iste vrste treba staviti u prostoriju u kojoj je
temperatura zraka oko 5°C. U nemogućnosti postavljanja pokusa u prostorije s odgovarajućom
razlikom u temperaturi biljke se mogu staviti i u komoru za klijanje biljaka na 20 -tak°C i u
hladnjak na 5°C. Kada se biljke prilagode uvjetima treba ih zamijeniti na slijedeći način.
Biljke iz prostora s temperaturom zraka 20°C prenijeti u prostor s temperatura zraka 5°C a
biljke koje su bile na 5°C prenijeti u prostor s temperaturom zraka 20°C. Nakon nekog
vremena biljke će reagirati a pomaci u gibanju organa će se lako uočiti vizualnim pregledom.
Brzina otvaranja cvijeta odnosno cvata ovisi o biljnom materijalu. Pomičnom mjerkom se
može izmjeriti promjer cvijeta, na način opisan u vježbi vase life, prije i nakon nastalih
promjena. Rezultate i zaključak zapisati.
Rezultati i zaključak
43
3.3.B FOTONASTIJE
Cilj
Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na svijetlost kao vanjski faktor
utjecaja.
Materijal
pribor i oprema:
vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom, veća kartonska kutija ili komora za klijanje biljaka,
pomična mjerka
biljni materijal:
cvjetovi tulipana (Tulipa sp.), cvatovi maslačka (Taraxacum officinale), cvatovi tratinčice
(Bellis perenis), cvatovi nevena (Calendula sp.), listovi kiselice (Oxalis acotesella)
reagensi:
vodovodna voda

Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s
vodom. Kako bi promatrali fotonastije jednu biljku izložimo direktnom svjetlu a drugu iste
vrste zamračimo ili je stavimo u komoru za klijanje biljaka pri čemu treba paziti kako bi obje
biljke bile izložene jednakoj temperaturi i vlažnosti zraka. Nakon 1 do 2 sata biljke će reagirati
na promjenu intenziteta svjetlosti. Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta, na
način opisan u vježbi vase life, prije i nakon nastalih promjena. Rezultate i zaključak zapisati.
Rezultati i zaključak:
44
Problemski zadaci:
1. Grašak je biljka za koju je karakteristično penjanje uz čvrstu podlogu pomoću vitica.
Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje?
2. Poznato je kako stidljiva mimoza (Mimosa pudica) prilikom mehaničkih podražaja listova
(npr. dodir rukom) skuplja svoje liske. Skupljanje liski se odvija vrlo brzo no faza
potpunog oporavka traje 30-tak minuta. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko
gibanje?
45
3.4. KLIJAVOST I VIGOR SJEMENA
3.4.A STANDARDNA KLIJAVOST I ENERGIJA KLIJANJA SJEMENA
Uvod u vježbu
Standardna klijavost i energija klijanja prihvaćeni su kao glavni pokazatelji fiziološke
kvalitete sjemena. Neizostavni su parametri za određivanje norme sjetve u cilju postizanja
željenog sklopa biljaka u polju te su kao takvi naišli na široku primjenu u praksi. Najveća
vrijednost ovih testova upravo je u preciznom predviđanju nicanja biljaka u polju, a
podudarnost ovih parametara s poljskim nicanjem je neupitna. Ovi parametri usko su vezani i
s potencijalnim prinosom, uglavnom preko ostvarenog sklopa biljaka u polju, ali i značajnim
utjecajem na rani porast biljaka (više je vezan uz energiju klijanja). Standardna klijavost
predstavlja broj normalnih klijanaca prema ukupnom broju sjemenki stavljenih na
naklijavanje. Ispitivanje se obavlja na radnom uzorku jedne partije sjemena u laboratorijskim
uvjetima. U okviru ovoga testa utvrđuje se i energija klijanja kao informativni podatak, a
razlika u odnosu na standardni test klijavosti je u vremenu naklijavanja koje je kraće, pa se u
okviru istoga testa prvo utvrđuje energija klijanja, a zatim standardna klijavost. Oba
pokazatelja predstavljaju broj normalnih klijanaca građenih na način da nije ugrožen rast i
razvoj mlade biljke što se, ovisno o biljnoj vrsti, odnosi na njezine osnovne dijelove (korijenov
sustav, izdanak, kotiledone i koleoptilu). Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije
klijanja pojedinih ratarskih kultura značajno se razlikuju, tablica 4.
Tablica 4. Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih

kultura
Period
Temperatura Period za
Veličina Masa Masa za
°C ocjenu Minimalna
partije prosječnog radnog ocjenu
Biljna vrsta (stalna ili standardne klijavost
sjemena uzorka uzorka energije
izmjenjiva) klijavosti (%)
(kg) (g) (g) klijanja
(dani)
(dani)
Glycine max (L.)
Merr.
25000 1000 500 20-30;25 5 8 80
Helianthus annuus L. 20000 1000 200 20-30;25;20 4 10 85
Hordeum vulgare L. 25000 1000 120 20 4 7 85
Medicago sativa L. 10000 50 5 20 4 10 80

Triticum aestivum 25000 1000 120 20 4 8 85
Zea mays L. 40000 1000 900 20-30; 25;20 4 7 90
46
Cilj
Odrediti klijavost sjemena dvije različite sorte graha.
Materijal
pribor i oprema:
kalupi za cvjetne nasade, boca špricalica, filter-papir, gumica za zimnicu, plastična čaša,
laboratorijska čaša, flomaster, elastični metar, crna vreća za smeće, vaga, komora za klijanje
biljaka
biljni materijal:
sjeme graha dvije sorte (pri izboru sorte graha dobro je izabrati jednu sortu niskog rasta a
drugu visokog rasta)
reagensi:
destilirana voda

Prije vježbe potrebno je izbrojati i izvagati 100 sjemenki graha od svake sorte. Nekoliko sati
prije vježbi sjeme je potrebno potopiti u vodu kako bi se potaklo njegovo klijanje. Nakon što
je sjeme absorbiralo dovoljnu količinu vode višak je potrebno isipati a sjemenke složiti na arak
filter-papira. Ovisno o sorti koju smo izabrali sjemenke mogu biti različite veličine te u skladu
s tim na arak treba složiti 20 do 50 sjemenki graha. Arak filter-papira treba postaviti
horizontalno te ga podijeliti na tri jednaka dijela po dužoj
stranici. Jedna trećina filter-papira se presavije po dužini.
Sjemenke graha se slože u jednom redu na sredinu dva
sloja filter-papira (slika 21). Sjemenke neka budu jednako
okrenute kako bi klice neometano mogle klijati jedna
pokraj druge. Kako bi osigurali dovoljnu količinu vlage
potrebne za klijanje sjemena pomoću boce špricalice
filter-papir se natopi vodom. Pri tome je potrebno
pripaziti kako se ne bi nasipalo suviše vode. Nakon toga
se preostala jedna trećina filter-papira presavije preko
sjemenki graha. Tako složen filter-papir se čvrsto zarola
od jednog kraja prema drugom poput štrudle a smotuljak
dodatno učvrsti gumicom za zimnicu. Smotuljak okomito
treba postaviti u kalup za nasađivanje cvijeća (slika 21).
Prilikom postavljanja smotuljaka u kalup neka smotuljci
budu orijentirani otvorom prema gore kako bi sjemenke
prilikom rasta mogle proklijati izvan filter-papira.
Smotuljke je potrebno obilježiti kako bi znali koja sorta
Slika 21. Postavljanje testa za
graha je u kojem smotuljku. Ako nije pristupačna klima ispitivanje klijavosti standardnom
komora sa mogućom regulacijom vlage (fitotron), svi
metodom na filter-papiru
smotuljci se zajedno s kalupom stave u neprozirnu
vreću za smeće kako bi gubitak vode bio sveden na
minimalnu količinu. Sjeme graha se stavlja u komoru za klijanje biljaka na 20°C u periodu od
tjedan dana. Nakon tjedan dana napravi se analiza rasta. Prebroji se koliko sjemenki graha je
proklijalo a koliko nije te se izračuna postotak klijavosti za svaku sortu graha. Elastičnim
metrom izmjeri se koliko su dugačke klice svake proklijale sjemenke i izračuna srednju
vrijednost klijanaca za svaku sortu. Noktom se pažljivo odvoje kotiledoni od hipokotila te se
hipokotili izvažu za svaku sortu graha posebno. Izračuna se prosječna masa klijanaca.
47
Usporedbom dobivenih rezultata može se zaključiti koja sorta graha ima bolje kvalitete
sjemena.
Energija klijanja i klijavost utvrđuju se brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda

predviđenog za naklijavanje (slika 22). Za razliku od normalnih klijanaca, klijanci za koje se
ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak
klijavosti. Takvi klijanci su oštećeni (nedostaje ili je oštećena neka od osnovnih struktura),
deformirani (na jednoj ili više osnovnih struktura prisutan je deformitet) ili istruli. U postotak
klijavosti također se ne uračunava niti mrtvo sjeme koje ne pokazuje znakove razvoja klice,
prazno sjeme te sjeme oštećeno napadom kukaca. Prilikom prvog, a i ostalih ocijenjivanja
izdvajaju se normalni klijanci, a nedovoljno razvijeni i deformirani klijanci, kao i neklijavo
sjeme, ostavljaju se do kraja ispitivanja klijavosti. Rezultat se izražava u %, a suma postotaka
normalnih i deformiranih klijanaca te neklijavog sjemena mora biti 100. Pri tome partija
sjemena koja je namijenjena za distribuciju mora zadovoljiti propisanu minimalnu klijavost
(tablica 4).
Slika 22. Utvrđivanje klijavosti sjemena graha (lijevo) i

soje (desno) standardnom metodom na filter-papiru
Rezultati
1 sorta graha 2 sorta graha

% NEP. d hip [mm] m [g] % NEP. d hip [mm] m [g]
1.
2.
3.
Ukupno
% NEP. – postotak neproklijalih sjemenki graha

d hip [mm] – srednja vrijednost dužine klica sjemenki graha izražena u milimetrima
m [g] – srednja vrijednost mase klijanaca graha izražena u gramima
48
Problemski zadaci
1. Izračunaj koliko grama sjemena treba posaditi na 10 m2 ako želimo da nam proklija 200
biljaka? Pri računanju uvrsti podatke dobivene iz postavljenog pokusa.
49
3.4.B COLD TEST
Uvod u vježbu
Za podrobniju ocjenu kvalitete sjemena uz test standardne klijavosti i energije klijanja
preporučuje se provesti i druge testove vigora sjemena od kojih posebnu važnost ima cold test.
Ovaj test ima osobiti značaj kod analize partija sjemena s graničnim vrijednostima standardne
klijavosti i energije klijanja, dulje skladištenih partija sjemena, osobito ako je skladištenje bilo
neuvjetno, te partija sjemena loših fizikalnih pokazatelja i narušenog zdravstvenog stanja.
Nadalje, cold test ima veliku važnost ukoliko se prakticiraju rani rokovi sjetve kada postoji
velika opasnost od redukcije sklopa biljaka (hladno tlo saturirano vlagom, prisutnost patogena,
produljen period od sjetve do nicanja) jer će tada, u odnosu na ostale testove vigora sjemena,
cold test dati najbolju procjenu poljskog nicanja. Generalno se može reći da partije sjemena s
većim vrijednostima cold testa u pravilu ostvaruju bolje poljsko nicanje, osobito u lošijim
uvjetima u polju.
Cilj
Odrediti postotak klijavosti sjemena ratarskog usjeva, po dale opisanoj metodi cold testa
Materijal
pribor i oprema:
rolani filter-papir, plastične vrećice, klima komora, tlo i pijesak u omjeru 1:1
biljni materijal:
sjeme kukuruza ili soje
reagensi:
vodovodna voda

Pripremi se podloga za sjetvu uzimanjem prosječnog uzorka tla s table na kojoj je prethodne
godine uzgajana testirana kultura.
Uzorak tla se osuši, usitni i
prosije, kako bi se postigla fina
mrvičasta struktura. Tako
pripremljen uzorak tla pomiješa
se s pijeskom u omjeru 1:1.
Postupak naklijavanja je sljedeći:
prethodno navlaženi filter-papir
stavi se na hlađenje (10°C) 24 h
prije sjetve, kao i pripremljena
smjesa pijeska i tla. Na navlaženi
i ohlađeni filter-papir rasporedi
se sjeme koje se zatim pospe sa
100 g smjese pijeska i tla. Radni
uzorak čini 4x50 sjemenki,
sjemenke se iz uzorka uzimaju
nasumce i raspoređuju na
podlogu za klijanje. Filter-papir
se zatim preklopi i dodatno Slika 23. Cold test sjemena soje po modificiranoj
navlaži s onoliko vode koliko «Rolled towel» metodi
mogu upiti papir i podloga.
50
Posijani uzorak zamota se u tuljak, stavi u plastičnu vrećicu i vertikalno odloži u termostat na
temperaturu 10°C, bez utjecaja svjetla. Potom slijedi naklijavanje na temperaturi 25°C u
trajanju od 5 dana, također bez prisutnosti svjetla. Konačno očitavanje klijavosti slijedi nakon
ukupno 12 dana (slika 23). Ovoj metodi, uz moguće modifikacije, podliježu slijedeće kulture:
kukuruz, soja, grašak i suncokret.
Kao i kod testa standardne klijavosti, i cold test se utvrđuje brojanjem normalnih klijanaca
nakon perioda predviđenog za naklijavanje i izražava se u %. Za razliku od normalnih
klijanaca, klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne
uračunavaju se u postotak klijavosti (oštećeni, deformirani i istruli klijanci te mrtvo sjeme).
Rezultati
51
3.4.C ELEKTRIČNI KONDUKTIVITET SJEMENA
Uvod u vježbu
Gubitak vigora sjemena uvelike je vezan uz stanje staničnih memebrana i sjemenjače, a
povećanjem propusnosti navedenih struktura redovito dolazi do opadanja vigora sjemena.
Upravo na ovim činjenicama utemeljena je metoda testiranja vigora sjemena putem
utvrđivanja električnog konduktiviteta sjemena kojim se mjeri intenzitet ispiranja elektrolita iz
biljnog tkiva tijekom namakanja sjemena u vodi. U osnovi, vrijednost električnog
konduktiviteta predstavlja stupanj provodljivosti otopine u kojoj je sjeme namakano i bit će
veći ukoliko tijekom namakanja otpuštanje elektrolita bude veće. Nadalje, intenzivnije
otpuštanje elektrolita tijekom namakanja veće je što je propusnost sjemenjače i staničnih
membrana veća pa otuda pad vigora sjemena redovito prati porast električnog konduktiviteta
sjemena. Ovdje treba naglasiti i činjenicu da što je sjeme nižeg vigora, ima nižu klijavost,
energiju klijanja i cold test, dok mu je električni konduktivitet u porastu, pa je korelacija
konduktiviteta sjemena s ostalim laboratorijskim pokazateljima, kao i s poljskim nicanjem,
redovito negativna.
Cilj:
Odrediti promjene električnog konduktiviteta sjemena soje u fazi imbibicije kroz određeni
vremenski period.
Materijal
pribor i oprema:
konduktometar, plastične čašice
biljni materijal:
sjeme bilo kojeg ratarskog usjeva
reagensi:
destilirana voda

Radni uzorak čini 4x50 sjemenki koje se
prethodno izvažu, a zatim stavljaju na
namakanje u Erlenmeyerove tikvice u 250 mL
deionizirane vode. Voda je temperirana na
20°C, a uzorci se zatim odlažu u termostat na
istu temperaturu od 20°C u trajanju od 24 h. Po
isteku vremena predviđenog za namakanje
sjemena obavlja se mjerenje električnog
konduktiviteta. Neposredno prije mjerenja Slika 24. Utvrđivanje električnog
pripremljeni uzorak lagano se miješa u konduktiviteta sjemena soje
trajanju od 10-15 sekundi, a zatim se konduktometrom
konduktometrom izvrši mjerenje (slika 24) i očitaju dobivene vrijednosti. Ova metoda razvila
se na grašku, primjenjuje se na ostalim krupnozrnim leguminozama, ali i na kukuruzu, pšenici
i nekim drugim kulturama.
52
Očitane vrijednosti s konduktometra (µScm-1) odnose se na ukupnu masu namakanog uzorka
(50 sjemenki). Stoga se utvrđena vrijednost preračuna na masu od 1 g sjemena i izrazi u µScm-
1 -1
g . Dobiveni rezultati ocjenjuju se prema skali za krupnozrne leguminoze (Powell i
Matthews, 1981., tablica 5).
Tablica 5. Skala za ocjenu vrijednosti električnog konduktiviteta za krupnozrne

leguminoze
Električni konduktivitet Ocjena kvalitete sjemena

(µScm-1g-1 ) i preporuka za sjetvu
<25 sjeme prikladno i za ranu sjetvu
25-29 sjeme može biti prikladno za ranu sjetvu, ali uz određeni rizik
30-43 sjeme nije prikladno za ranu sjetvu i nepovoljne uvjete
>43 sjeme neprikladno za sjetvu
53
3.4.D ZDRAVSTVENO STANJE SJEMENA
Uvod u vježbu
Važan činitelj vigora sjemena je i njegovo zdravstveno stanje. Naime, sjeme može biti
zaraženo velikim brojem gljivica, bakterija i virusa, a uslijed infekcije patogenima može
značajno opasti vigor sjemena. Brojni radovi potvrđuju negativnu korelaciju između
intenziteta zaraze sjemena pojedinim patogenima i vigora, pa se generalno može reći da se
vigor sjemena proporcionalno smanjuje s povećanjem intenziteta zaraze. Većina uzročnika
bolesti prenosi se sjemenom pa korištenje zdravog sjemenskog materijala ima važno mjesto i u
prevenciji i smanjivanju pojavnosti bolesti. Osim toga, veća zaraženost sjemena uzročnicima
bolesti utvrđenim zdravstvenom kontrolom upućuje na potrebu tretiranja sjemena. U
konačnici, partije sjemena lošijeg zdravstvenog stanja neće ostvariti željene sklopove biljaka u
polju, bolesni klijanci oslabit će i zaostati rastom i razvojem, a sve to negativno će se odraziti
na prinos. Stoga treba izdvojiti nekoliko aspekata koji daju veliku važnost provedbi
zdravstvene analize sjemena. Kao prvo, zdravstvenu analizu treba uvažiti kao nadopunu
ostalim testovima vigora sjemena i boljem uvidu u stvarno stanje pojedine partije sjemena.
Zatim treba navesti rizik koji sa sobom nosi sjetva zaraženim sjemenom - od prorjeđivanja
sklopa, stagnacije usjeva, razvoja bolesti u polju, smanjenja prinosa i komercijalne vrijednosti
usjeva uopće. Nadalje, rezultati ispitivanja zdravstvenog stanja sjemena mogu ukazati na
nužnost provođenja tretiranja sjemena u cilju iskorjenjivanja patogena koji se prenose
sjemenom ili smanjenja opasnosti od prijenosa zaraze. Posebnu važnost ima zdravstvena
analiza uvezenih partija sjemena zbog mogućeg unosa novih patogena i opasnosti za domaću
proizvodnju. Ispitivanje zdravstvenog stanja sjemena provodi se primjenom različitih metoda,
a odnosi se na utvrđivanje prisutnosti uzročnika bolesti (gljivice, bakterije i virusi i ostale),
parazitskih nematoda i kukaca, ali i štetnih fizioloških stanja. Metode zdravstvene analize
sjemena mogu se podijeliti na dvije osnovne skupine ovisno o tome prethodi li im proces
inkubacije:
1. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja bez inkubacije

Ove metode ne daju podatke o vijabilnosti patogena.
a) Metoda pregleda naturalnog sjemena

Metoda se svodi na vizualni pregled uzorka uz moguću upotrebu stereo-mikroskopa. Tako se
vizualnim pregledom sjemenjače utvrđuje prisutnost plamenjače na sjemenu soje
(Peronospora manshurica (Naum) Syd. Ex Gaum). Pregled sjemena na plamenjaču provodi se
na netretiranom sjemenu, radni uzorak čini 4x50 sjemenki, a konačan rezultat izražava se u
postotku sjemena zahvačenog plamenjačom. Nadalje se, metodom vizualnog pregleda, mogu
utvrditi promjene boje i oštećenja sjemena, prisutnost sklerocija, cisti nematoda, kukaca i
grinja.
b) Metoda ispiranja sjemena

Metoda ispiranja sjemena koristi se za analizu sjemena strnih žita i trava na prisutnost
patogena Tilletia spp. Radni uzorak (50 g sjemena za strna žita) stavlja se u tikvicu i prelije sa
70 mL destilirane vode uz dodatak 2 kapi tekućeg deterdženta za pranje suđa. Tikvica se
začepi i mućka u trajanju od 10 minuta (ručno ili na automatskoj mućkalici). 10 mL suspenzije
dobivene mućkanjem centrifugira se 4 minute na 2400 okretaja. Odlije se tekućina iznad
taloga i dodaje destilirana voda do 2 mL, te napravi suspenzija taloga. Iz svake kivete
mikroskopira se najmanje 4 kapi. Prisutne hlamidospore izbroje se korištenjem
hemacitometra.
54
Broj spora u gramu sjemena se izračunava po formuli:
N ∗V
X =
0.0001 ∗ W
N - prosječan broj spora u kvadratu hemacitometra (ukupan zabilježeni broj/8)

V [mL] - volumen suspenzije (2 mL)
W [g]- masa sjemena
0.0001 - volumen tekućine u kvadratu hemacitometra.
c) Metoda pregleda embrija

Ova metoda koristi se na sjemenu ječma za određivanje zaraze prašnom snijeti (Ustilago
nuda). Radni uzorak mase 200-240 grama tretiranog ili netretiranog sjemena podijeli se na dva
ponavljanja. Ekstrakcija i čišćenje embrija obavlja se tako da se radni uzorak stavi u jednu
litru svježe pripremljene 5%-tne vodene otopine natrijeve lužine (NaOH) i drži 24 sata na
20°C. Nakon toga cijeli se uzorak premjesti u prikladni kontejner i ispere u toploj vodi, da se
odvoje embriji, koji izlaze kroz smekšani perikarp. Embriji se izdvoje pomoću sita s otvorima
promjera 1 mm. Zatim se embriji premjeste u mješavinu jednakog omjera glicerola i vode,
gdje se odvajaju od eventualnih ostataka sjemena. Dodatno čišćenje embrija obavlja se u
digestoru tako da se embriji premjeste u laboratorijsku posudu u kojoj se nalazi 75 mL čistog
svježe pripravljenog laktofenola. Embriji se u laktofenolu drže 30 sekundi, pri točki ključanja.
Na kraju se embriji premjeste u svježi, lagano zagrijani glicerol, kako bi se obavio pregled.
Pregledava se 1000 embrija iz svakog ponavljanja pod povećanjem 16 – 25 puta, s prikladnim
osvjetljenjem (odozdo). Traži se karakterističan zlatno-smeđi micelij gljivice Ustilago nuda.
Rezultat pregleda izražava se u % zaraženog sjemena.
2. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja nakon inkubacije
Nakon razdoblja inkubacije

radni se uzorak ispituje na
prisutnost uzročnika bolesti,
simptome razvoja bolesti,
prisutnost štetnika i štetnih
fizioloških stanja na ili u
sjemenu te na klijancima. Može
se odrediti površinska ili
dubinska zaraza.
a) Metoda na filter-papiru
Radni uzorak od 400 sjemenki
rasporedi se u Petrijeve zdjelice
(po 10 zrna u jednoj Petrijevoj Slika 25. Utvrđivenje zdravstvenog stanja sjemena soje
zdjelici). Petrijeve zdjelice po metodi na filter-papiru
prethodno su obložene
55
navlaženim filter-papirom, na koji se sjemenke rasporede tako da je njihova međusobna
udaljenost najmanje 2 cm. Tako „posijano“ sjeme odlaže se u termostat na inkubaciju.
Inkubacija za netretirano sjeme traje 10 dana, a 14 dana za tretirano sjeme pri temperaturi od
20°C, uz izmjenično osvjetljenje (12 sati osvjetljenja u spektru od 320 do 420 nm, 12 sati u
tami). Nakon inkubacije slijedi determinacija i utvrđivanje postotka zaraze sjemena. Metoda
se primjenjuje na sjemenu soje (Slika 25), sucokreta i jarog graška.
b) Metoda izmrzavanja
Metoda izmrzavanja predstavlja modificiranu metodu na filter-papiru, a primjenjuje se na
sjemenu ozime pšenice i ozimog ječma. Modifikacija se odnosi na temperaturu inkubacije.
Naime, prilikom inkubacije sjeme se prvo stavlja u komoru za naklijavanje na 20°C kroz 24
sata, zatim sljedećih 24 sata u zamrzivaču na -20°C. Nakon toga Petrijevke sa sjemenom drže
se u komori za naklijavanje na 20°C do kraja inkubacije (osim kod determinacije gljive
Microdochium nivale gdje temperatura u komori za naklijavanje mora biti 15-18°C).
c) Metoda na hranjivoj podlozi

Metoda na hranjivoj podlozi koristi se za utvrđivanje zaraze sjemena pšenice sa smeđom
pjegavosti pljevica, gljivicom Leptosphaeria (Stagonospora) nodorum (syn. Septoria
nodorum). Prije stavljanja radnog uzorka (400 sjemenki) na hranjivu podlogu obavlja se
predtretman (dezinfekcija) u 1%-tnoj otopini natrijeva hipoklorita. Kao hranjiva podloga
obično se koristi krumpir-dekstroza agar (PDA) ili malc agar, u koji se kod pripreme dodaje
100 ppm streptomicin sulfata. Hranjiva podloga izlijeva se u petrijive zdjelice promjera 9 cm.
Kod stavljanja sjemenki u Petrijeve zdjelice razmak treba biti najmanje 2 cm. Nakon toga se
Petrijeve zdjelice sa sjemenkama stavljaju na inkubaciju 7 dana na 20°C u mraku. Nakon 7
dana golim okom se određuje broj sjemenki s karakterističnim kolonijama, spororastućeg,
gustog bijelog ili kremastog micelija, koje često prekrivaju cijelo sjeme. Rezultat analize
izražava se u % zaraženog sjemena.
d) Predtretman (prethodna obrada)

Pojedine gljivice (npr. Rhizopus spp.) brzo se šire na filter-papiru, mogu prorasti zdravu biljku
ili se razvijati s patogenom na zaraženom sjemenu. Na taj način ugrožavaju sam ishod analize
jer mogu „maskirati“ konačan rezultat. Iz tog je razloga za pojedine metode poželjno izvršiti
predtretman koji se odnosi na bilo kakav fizikalni ili kemijski tretman radnog uzorka proveden
u laboratorijskim uvjetima. Tako se u slučaju potrebe za površinskom dezinfekcijom sjemena
može provesti predtretman natrijevim hipokloritom namakanjem sjemena u trajanju od 10
minuta u otopini natrij hipoklorita koja sadrži 1 volumni % aktivnog klora.
Rezultati
Rezultati zdravstvene analize prikazuju se kao postotak zaraženih sjemenki ili kao broj
organizama po težini ispitanog uzorka. Pri tome je nužno rabiti znanstvena imena uzročnika
bolesti, naznačiti metodu zdravstvene analize koja je korištena, uključujući i podtretman, ako
je proveden.
56
3.5. ANALIZA RASTA BILJAKA
Uvod u vježbu
Visokoproduktivni uzgoj biljaka zahtjeva postizanje optimalnih uvjeta prilikom rasta i razvoja
biljaka. Temperatura, osvjetljenje i dovoljna količina vode važni su faktori koji utječu na
dobivanje zdrave i snažne biljke s dobro razvijenom lisnom površinom i dobrim prirastom.
Kvalitetna gnojidba također ima značajan učinak na povećanje poljoprivrednog uroda i
priroda.
Cilj
Naučiti modele analize rasta biljaka te na primjerima utvrditi naučeno.
RELATIVNA BRZINA RASTA (R)
Relativna analiza rasta ili njenih pojedinih organa u određenom vremenskom razdoblju
izražava se kao prirast u jedinici suhe tvari:
1 dW
R= ×
W dt
W = ukupna masa suhe tvari biljke

dW = prirast mase suhe tvari
dt = vremenski interval
Primjer:
Nakon 100 dana vegetacije prosječna masa suhe tvari korijena šećerne repe iznosi 50 g, a
nakon 180 dana 100 g. Kakva je relativna brzina rasta u ispitivanom razdoblju od 80 dana?
1 50 g
R= × = 0,00625g / dan
100 80dana
NETO ASIMILACIJA (E)
Vrijednost čistog efekta asimilacije izračunava se na slijedeći način:
1 dW
E= ×
A dt
Neto asimilacija (E) je prirast suhe tvari izražen na jedinicu veličine koja pokazuje aktivnost
fotosintetičkog aparata biljke (površina lišća, ukupni i proteinski dušik u lišću, količina
klorofila a i sl.). Zavisnost između A (asimilacijska površina) i W (suha tvar biljke) može biti
linearna ili kvadratna.
Kod linearnog oblika zavisnosti jednadžba se raščlani prema Wiliamsu:
57
dW × (ln A2 − ln A1 )
E=
dA × dt
Kod kvadratnog oblika zavisnost jednadžbi glasi:
dW
E = 2×
( A2 + A1 ) × dt
Primjer:
Nakon 60 dana vegetacije prosječna površina lišća jedne repe je 22 dm2 uz masu suhe tvari od
25 g. Nakon 30 dana lisna površina bila je 34 dm2, a masa suhe tvari 60 g. Kolika je prosječna
neto asimilacija uz pretpostavku linearne zavisnosti između lisne površine i suhe tvari biljke?
(60 − 25) × (ln 34 − ln 22)

E= = 0,04 g / dan / dm 2
(34 − 22) × (90 − 60)
PRODUKTIVNOST (C)
Veličina prirasta ili produktivnost izražava se prema jednadžbi:
dW
C=
dt × P
dW = razlika između dva uzastopna mjerenja produktivnosti

(primarne – prinos ili biomase kod utvrđivanja prirasta populacije)
P = površina tla na koju se produktivnost odnosi
Primjer:
Na 10 ha utvrđen je biološki prinos šećera šećerne repe 6,5 t/ha nakon 160 dana vegetacije, a
20 dana kasnije 8,1 t/ha. Kolika je produktivnost usjeva?
8,1 − 6,5
C= = 0,008t / ha / dan
(180 − 160) × 10
PROPORCIONALNA LISNA POVRŠINA (lisnatost, F)
Proporcionalna lisna površina je omjer lisne površine i ukupne mase suhe tvari.
A
F=
W
Ovaj pokazatelj je relativna mjera fotosintetičke aktivnosti lišća i značajan je za utvrđivanje
razlika između pojedinih sorti i biljnih vrsta. Zavisi od doba vegetacije.
58
LISNA POKROVNOST (LAI)
Lisna pokrovnost (LAI) je omjer između lisne površine populacije i površine tla kojoj ona
pripada. Optimalna vrijednost LAI ima vrlo značajnu ulogu u produktivnosti biljaka. Teorijski
optimum LAI je onda kada i najniži listovi dobivaju toliko svjetla da je omjer između
fotosinteze i disanja veći od 1 (iznad kompenzacijske točke). Razlike između sorata mogu
većim dijelom potjecati upravo od razlika u LAI jer je produktivnost fitocenoza (C) umnožak
prosječne lisne pokrovnosti i čistog efekta asimilacije (E):
C = L× E
Optimalna veličina LAI za poljoprivredne vrste je između 3 i 5, a za travne fitocenoze 7 do 10
i zavisi uglavnom od vertikalne strukture fitocenoze.
Integralna površina (LAD) je mjerilo sposobnosti biljaka da održe stvorenu lisnu površinu, što
podrazumijeva i regeneraciju izgubljenog lišća. LAD se može brojčano iskazati kao površina
ispod krivulje lisne površine u razdoblju vegetacije.
Primjer:
Jedna biljka pšenice ima razvijenih 5 listova prosječne površine 10, 12, 17, 25 i 32 cm2. Koliki
je LAI ako je sklop usjeva 700 biljaka/m2?
700 × 10 = 7000
700 × 12 = 8400
700 × 17 = 11900
700 × 25 = 17500
700 × 32 = 22400
Σ= 67200 cm2 = 6,72 m2/m2 tla
FOTOSINTETIČKI POTENCIJAL (FP)
Veličina fotosintetičkog potencijala povezana je s otpornošću sorata prema nepovoljnim

uvjetima. Prinos zrna pšenice stvara se uglavnom fotosintetičkom aktivnošću asimilacijskih
organa u drugoj polovini vegetacije, zbog čega je naročito značajna veličina FP u razdoblju
poslije klasanja.
( A2 − A1 )
FP = × dt( m 2 dan )
2
59
ŽETVENI INDEKS (ŽI)
Žetveni indeks (ŽI) je postotni udjel poljoprivrednog prinosa (urod) u ukupnoj biomasi
(poljoprivredni prinos ili prirod).
Pp × 100
ŽI = [%]
Bp
Primjer:
Ako je biološki prinos biljke (Bp) 4,502 g a prinos zrna (Pp) je 2,001 g koliki je udjel uroda u
prinosu biljke?
Biološki prinos biljke = 4,395 g (Bp)

Prinos zrna biljke = 1,893 g (Pp)
2,001× 100
ŽI = [%]
4,502
60
3.6. UTVRĐIVANJE ALELOPATSKIH ODNOSA U KLIJANJU
Uvod u vježbu
Alelopatiju predstavljaju međusobni odnosi između biljnih vrsta koji se uspostavljaju putem
specifičnih kemijskih supstanci koje biljke sintetiziraju i izlučuju u okolinu. Ova pojava se
javlja između različitih biljnih vrsta “divljih” i “kulturnih” biljaka, a također postoji i u odnosu
prema mikroorganizmima, a može se javiti u svim fazama razvoja biljnog organizma.
Djelovanje sintetiziranih kemijskih supstanci se odražava na karakter i intenzitet fiziološko-
biokemijskih procesa u biljkama, kao što su klijanje, rast, minerqalna ishrana, fotosinteza i
disanje. Postojanje alelopatski odnosi u fazi klijanja sjemena se utvrđuje se izračunavanjem
postotka isklijalih sjemenki različitih biljnih vrsta bez prisustva drugih sjemenki i u
kombinacijama sa sjemenkama jedne ili dvije druge biljne vrste.
Cilj
Utvrditi postojanje alelopatskih odnosa u fazi klijanja sjemena između različitih biljnih vrsta.
Materijal
pribor i oprema:
Petrijeve zdjelice, filter-papir, folija za konzerviranje, klima komora
biljni materijal:
sjeme: kukuruza, suncokreta, soje, graha, pšenice, ječma, zobi, raži
reagensi:
0,1%-tni HgCl2 - otopina za ispiranje sjemena (1 g HgCl2 otopa se u 2,5 mL koncentrirane
HCl i nadopuni destiliranom vodom do 1000 mL);
1%-tna otopina AgNO3-reagens za kontrolu uspješnosti ispiranja (1 g AgNO3 otopiti u 60-ak
mL destilirane vode, dodati 1-2 kapi dušične kiseline i nadopuniti vodom do 100 mL).

Prije postavljanja pokusa potrebno je obaviti dezinfekciju sjemena kako bi se uklonila epifitna
mikroflora koja može biti specifična za pojedinu vrstu sjemena, te na kraju utjecati na postotak
klijavosti, što ne bi bio realan pokazatelj alelopatskih odnosa između biljaka. Dezinfekcija se
vrši potapanjem sjemna 3-5 minuta u 0,1 % otopinu HgCl2. Nakon dezinfekcije sjeme se ispire
destiliranom vodom. U destiliranu vodu kojom je sjeme isprano dodaje se nekoliko kapi 1 %
otopine AgNO3, kako bi provjerili uspješnost ispiranja. Ako se voda zamuti, potrebno je
ponoviti ispiranje sve dok voda nakon dodavanja AgNO3 ne ostane bistra. Sjeme se na klijanje
postavlja u Petrijeve zdjelice istih dimenzija ili u filter papir. Za pokus se koristi sjeme tri
različite biljne vrste, ali sličnih dimenzija sjemena, npr.:
1. kukuruz, suncokret, soja
2. kukuruz, suncokret, grah
3. pšenica, ječam, zob
4. pšenica, ječam, raž
5. konoplja, grahorica, rotkvica
6. ljulj, gorušica, lucerna.
61
Na Petrijeve zdjelice postavi se filter papir i navlaži destiliranom vodom te se na papir
ravnomjerno rasporedi 50 sjemenki po slijedećoj shemi:
1. 50 sjemenki biljne vrste broj 1 (npr. pšenica)
2. 50 sjemenki biljne vrste broj 2 (npr. ječam)
3. 50 sjemenki biljne vrste broj 3 (npr. zob)
4. 25 sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 2 (pšenica i ječam)
5. 25 sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (pšenica i zob)
6. 25 sjemenki biljne vrste broj 2 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (ječam i zob)
7. po 17 sjemenki svake od tri ispitivane biljne vrste (pšenica, ječam i zob)
Sjemenke se prekriju drugim filter papirom koji se također navlaži destiliranom vodom,
zdjelice se prekriju zaštitnom foliju i postave na 25°C u klima komoru. Ako se sjemenke
postavljaju na filter papir veličine A3 formata, papir je potrebno navlažiti i smotati u "rolu" te
također postaviti na 25°C u klima komoru. Postotak klijanja sjemenki evidentira se svaki dan
nakon početka klijanja , do sedmog dana klijanja, te se alelopatski odnosi utvrđuju kao razlika
u postotku klijanja sjemena u jednovrsnim, dvojnim i trojnim uzorcima. Biljke se mogu
uzgajati u istim kombinacijama 15 dana, te se utvrđuju alelopatski odnosi
preko razlika u masi svježe ili suhe tvari razvijenih biljaka.
Rezultati
Radi utvrđivanja alelopatije pri klijanju postavljen je pokus sa sjemenjem pšenice, ječma i
zobi. Nakon 7 dana broj proklijalih sjemenki bio je slijedeći:
pšenica ječam zob

posuda ukupno % razlika ukupno % razlika ukupno % razlika
1,2,3 40/50 10/50 35/50
4 14/25 3/25
5 20/25 10/25
6 1/25 15/25
7 6/17 3/17 0/17
U tablicu je potrebno upisati postotke klijavosti, te razlike u postotku klijavosti između

sjemena pojedinih biljnih vrsta.
62
4. FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA
4.1. ODREĐIVANJE DEFICITA DIFUZNOG PRITISKA (DDP)
Uvod u vježbu
Određivanje sile usvajanja vode (DDP) tkiva ili čitavih organa biljke obavlja se pronalaženjem
otopine čiji osmotski pritisak odgovara ispitivanom uzorku te u njemu ne dolazi do usvajanja
odnosno izdvajanja vode.
Praktično mjerenje DDP uz pomoć refraktometra
(slika 26) vrši se prema promjeni težine ili
volumena biljnog tkiva kao i promjene
koncentracije otopine u koju je tkivo potopljeno.
Izotonične otopine su otopine čiji je osmotski
potencijal, odnosno koncentracija otopljenih tvari
jednaka onoj u stanicama biljnog tkiva. Otopine
koje imaju manji osmotski potencijal, odnosno
koncentraciju otopljenih tvari u odnosu
na stanice biljnog tkiva su hipotonične i u njima
dolazi do povećanja koncentracije otopljenih tvari
uslijed prelaska vode u ispitivano tkivo koje
povećava svoj volumen. Otopine s većom početnom
koncentracijom zbog svog većeg osmotskog
potencijala “izvlače” vodu iz stanica tkiva
(plazmoliza), te pri tome smanjuju svoju
koncentraciju (sadržaj suhe tvari im se smanjuje) a
volumen tkiva se smanjuje. Takve otopine nazivaju
se hipertonične.
Slika 26. Refraktometar
Cilj
Odrediti silu usvajanja vode biljnog materijala pomoću refraktometra.
Materijal
pribor i oprema:
10 kemijskih epruveta, nož, metalna žlica, 5 odmjernih tikvica od 50 mL, stalak za epruvete,
pipeta od 10 mL, milimetarski papir, ravnalo, sat, vaga, refraktometar
biljni materijal:
gomolj krumpira
reagensi:
destilirana voda; otopine saharoze od 0,2 do 1 mol/dm3

Priredi se niz otopina saharoze od 0,2 do 1,0 mol/dm3 i prenese po 10 mL u dva niza epruveta.
U jedan niz otopina se potope komadići ispitivanog biljnog tkiva (podjednakog broja i
veličine). U otopinama bez biljnog tkiva se odredi refraktometrom refrakcijski indeks ili %
suhe tvari. Nakon 30 minuta utvrđuje se koncentracija otopina saharoze u kojima je bilo biljno
tkivo. Otopina u kojoj nema promjene koncentracije (% suhe tvari) ima osmotsku vrijednost
jednaku osmotskoj vrijednosti biljnog tkiva. U slučaju da se ta vrijednost nalazi između dvije
63
molarne koncentracije saharoze, tražena koncentracija se izračuna interpolacijom uz pomoć
kalibracijskog dijagrama. Na apscisu koordinatnog sustava se nanosi koncentracija saharoze
(0,2-1,0 M) a na ordinatu % suhe tvari otopine. Unošenjem podataka za otopine bez biljnog
tkiva i povezivanjem dobivenih točaka dobije se pravac broj 1, a podaci za otopine s biljnim
tkivom daju pravac broj 2. Iz sjecišta ovih pravaca se spuštanjem okomice na apscisu očitava
koncentracija (c) izotonične otopine saharoze.
DDP se računa prema izrazu:
DDP= −R×T ×i ×c
R [kPa dm3K-1mol-1] - opća plinska konstanta (8,314 kPa dm3K-1mol-1 ; 8,314 JK-1mol-1)
T [K]- apsolutna temperatura (K = 273 + °C)
c [mol dm -3] - koncentracija izotonične otopine saharoze
i - izotonični koeficijent Van’t Hoffa (za neelektrolite = 1, za elektrolite > 1, npr. za
NaCl i KCl = 1,5)
1. primjer rezultata analize, konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP:
br. koncentracija % ST u otopinama bez % ST 30 min. nakon potapanja

saharoze [mol/dm3] biljnog tkiva biljnog tkiva u otopine
(očitanje refraktometrom) (očitanje refraktometrom)
1. 0,2 6,3 6,8
2. 0,4 12,6 12,0
3. 0,6 18,4 17,3
4. 0,8 24,3 22,4
5. 1,0 30,0 26,9
Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni
pravac) i pravac % ST 30 min. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi
pravac). Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju
izotonične otopine (0,285 mol/dm3). Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama
saharoze (lijevo od sjecišta: samo otopina 0,2 mol/dm3) su hipotonične i u njima je došlo do
povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu, a desno od sjecišta su otopine s
višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do
pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu.
64
35
izotonična otopina
30
hipotonična otopina
25
20
% ST
15
hipertonične otopine
10
0
0,2 0,285 0,4 0,6 0,8 1,0 (c)
otopina saharoze nakon 3/4 h
Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18°C):
DDP = - 8,314 [kPa dm3 K-1mol-1]× 291[K] × 1 × 0,285 [mol dm-3]= - 689,5 kPa
2. primjer rezultata analize, konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP:

(očitanje refraktometrom) (očitanje refraktometrom)
1. 0,2 6,3 7,6
2. 0,4 12,6 12,8
3. 0,6 18,4 18,0
4. 0,8 24,3 23,2
5. 1,0 30,0 28,4
Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni
pravac) i pravac % ST 30 min. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi
pravac). Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju
izotonične otopine (0,47 mol/dm3). Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama
saharoze (lijevo od sjecišta: otopine 0,2 i 0,4 mol/dm3) su hipotonične i u njima je došlo do
povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu, a desno od sjecišta su otopine s
višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do
pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu.
65
35
izotonična otopina
30
25
% ST 20
hipotonične
15
otopine hipertonične otopine
10
0
0,47
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 (c)
otopina saharoze nakon 1/2 h
Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18°C):
DDP = - 8,314 [kPa dm3 K-1mol-1] × 291[K] × 1 × 0,47 [mol dm-3] = - 1137,1 kPa
66
Rezultati

1. 0,2
2. 0,4
3. 0,6
4. 0,8
5. 1,0
67
4.2. ODREĐIVANJE EVAPOTRANSPIRACIJE LISTA
Uvod u vježbu
Gubitak vode iz zeljastih biljnih dijelova značajno ovisi o temperaturi sredine i uvjetima
osvjetljenosti. Voda u obliku vodene pare izlazi iz lista najvećim dijelom kroz puči
(stomatalna transpiracija), ali i evaporacijom s površine, nakon prolaska kroz kutikulu. Ovisno
o kemijskom sastavu kutikule, biljne vrste se značajno razlikuju po intenzitetu gubitka vode
evaporacijom (kutikularna transpiracija).
Cilj
Utvrditi prosječni gubitak vode iz lista zeljastih biljaka u određenom vremenskom periodu.
Materijal
pribor i oprema:
laboratorijska vaga, klima komora
biljni materijal:
list neke zeljaste bijke (salata, kupus), list bršljana

Vaganjem se utvrdi svježa masa lista, slika 27. List se
izloži djelovanju različitih temperaturnih tretmana
(15, 25, 30oC), kao i utjecaju svijetlosti, odnosno
mraka. Nakon određenog perioda (npr. 2 h),
ponovnim vaganjem utvrdi se razlika u masi lista,
koja predstavlja gubitak vode evapotranspiracijom.
Evapotranspiracija se izrazi kao postotna razlika u
masi lista.
Rezultati
List zeljaste biljke
Početna masa lista na 15oC, u mraku: g
Konačna masa lista nakon 2 h: g
Intenzitet evapotranspiracije: %
Početna masa lista na 25oC, na svjetlu: g

Konačna masa lista: g
Slika 27. Vaganje lista
List bršljana
Početna masa lista na 15oC, u mraku: g
Konačna masa lista nakon 2 h: g
Početna masa lista na 25oC, na svjetlu: g

Konačna masa lista: g
68
Zbog čega se javlja razlika u intenzitetu evapotranspiracije lista zeljaste biljke i bršljana?
69
4.3. ODREĐIVANJE SADRŽAJA PROLINA
Uvod u vježbu
Jedna od najčešćih reakcija živih organizama na
vodni deficit je stvaranje i akumulacija osmotski
aktivnih neutralnih organskih spojeva kao što su
šećeri i neke aminokiseline (prolin; slika 28).
Povećanje koncentracije osmolita omogućuje da se
iz vanjske sredine usvoji dodatna količina vode a
osim toga kompatibilni osmoliti stabiliziraju
strukturu proteina. stoga ovakvi spojevi imaju
važnu ulogu u adaptaciji citoplazme na različite
vrste stresa. Prolin štiti membrane i proteine od Slika 28. Strukturna formula prolina
štetnog djelovanja visokih koncentracija (preuzeto s
anorganskih iona i temperaturnih ekstrema. http://commons.wikimedia.org/wiki/F
Akumulira se u citoplazmi gdje u stresnim uvjetima ile:(S)-Prolin.png )
može činiti i više od 80% slobodnih aminokiselina,
s koncentracijom i do 200 mM, čime značajno doprinosi osmotskoj regulaciji citoplazme.
Otpornost genotipova prema stresnim uvjetima može se ocijeniti prema sposobnosti
akumulacije slobodnog prolina.
Cilj
Odrediti sadržaj aminokiseline prolin u biljnom materijalu.
Materijal
pribor i oprema:
tarionik, tučak, špatula, staklene epruvete, plastične epruvete sa čepovima, lijevci, filter-papir
Whatman br. 2, posuda za inkubaciju na kupelji ili sušionik za suhu inkubaciju
biljni materijal:
0,5 g biljnog tkiva
reagensi:
sulfosalicilna kiselina; ninhidrin reagens; kvarcni pijesak; toluen; osnovni standard prolina

Ekstrakcija prolina iz stanica vrši se pomoću sulfosalicilne kiseline, slijedi reakcija s
ninhidrinom, koji s amino i imino grupama aminokiselina daje crvenkasto obojenje čiji
intenzitet ovisi o koncentraciji prolina se mjeri spektrofotometrijski na 520 nm nakon
odvajanja prolin-ninhidrin kompleksa (Ruheman's purple) toluenom, slika 29.
ninhidrin aminokiselina Ruheman's purple
Slika 29. Prikaz nastanka kompleksa Ruhenan’s purple koji daje specifično crvenkasto
obojenje, spajanjem ninhidrina i aminokiselina
70
0,5 g biljnog materijala se homogenizira s 10 mL sulfosalicilne kiseline uz dodatak kvarcnog
pijeska (na vrh noža) i profiltrira kroz filter papir Whatman br 2 u staklenu epruvetu.
Otpipetira se 2 mL filtrata u plastičnu epruvetu i doda 2 mL ninhidrin reagensa i 2mL ledene
octene kiseline. Inkubacija se vrši na 1000C 1 h, te se nakon inkubacije reakcija prekida
prenošenjem epruveta na led. Ekstrahirati prolin dodavanjem po 4 mL toluena, uz
vorteksiranje 15-20 s. Nakon što se epruvete zagriju na sobnu temperaturu i odvoji toluenski
sloj, automatskom pipetom se pipetira toluenski sloj s ekstrahiranim prolinom u kivetu za
spektrofotometar. Mjeri se transmisija na 520 nm uz podešavanje 0 čistim toluenom a 100%
transmisije s a standardom 0.
Standardi se rade paralelno sa uzorcima, dodavanjem ninhidrina i octene kiseline.

Radni standardi:
- u 6 epruveta otpipetira se:
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mL razr. osn. standarda +

2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 mL dest. vode
konc: 0 4 8 12 16 20 µg prolina /2 mL
Formula za preračuna sadržaja prolina na svježu tvar biljke:
5* X
Sadržaj prolina ( µg/gS SvT) =
odvaga uzorka u g
X [µg prolina/2 mL] - conc. prolina s kalibracijskog dijagrama (conc. standarda µg prolina/2
mL)
5 - razrjeđenje pri ekstrakciji (1 g uzorka u 10 mL sulfosalicilne kiseline, od toga 2 mL uzeto
za određivanje)
Rezultati
71
4.4. ODREĐIVANJE SADRŽAJA VITAMINA C
Uvod u vježbu
Askorbinska kiselina (C vitamin) se nalazi u različitim tkivima biljaka. Predstavlja značajan
reducens I poznato je da štiti klorofile od oksidativne fotodestrukcije kisikom koji se oslobađa
fotolizom vode. Također sudjeluje u zaštiti stanica od oksidacijskog stresa uzrokovanog
prisustvom slobodnih kisiskovih radikala. U prisustvu enzima oksidaze askorbinske kiseline
dolazi do oksidacije AK u DHAK (dehidroaskorbinsku kiselinu), stoga se ekstrakcija AK iz
tkiva vrši pomoću metafosforne kiseline, koja inaktivira prisutnu oksidazu u stanicama.
Cilj
Odrediti koncentraciju C vitamina (askorbinske kiseline) u biljnom materijalu
Materijal
pribor i oprema:
digitalni titrator, tarionik, tučak, lijevci, filter-papir, Erlenmeyer tikvica 200 mL
biljni materijal:
plod paprike
reagensi:
DCIP (2,6-diklorofenol-indofenol); AK (askorbinska kiselina); metafosforna kiselina

Reagens DCIP (2,6-diklorofenol-indofenol) ima plavu boju u alkalnoj a ružičastu u kiseloj
sredini. AK ga reducira u bezbojni oblik pri čemu se sama oksidira do DHAK
(dehidroaskorbinska kiselina; slika 30).
Prema tome, 1 mL otopine askorbinske kiseline (AK) titrira se sa DCIP (diklorofenol-
indofenol). Pri titraciji ružičasta boja treba ostati 15 s. 1 g tkiva izmacerirati s metafosfornom
kiselinom, profiltrirati i 5 mL ekstrakta titrirati s DCIP. Kada se pri titraciji AK ekstrahirane iz
biljnog tkiva metafosfornom kiselinom dodaje DCIP, AK se prevodi u DHAK (slika 30), a
otopina ostaje bezbojna sve dok se ne potroši sva količina AK u uzorku. Daljnjim dodavanjem
DCIP otopina ostaje ružičasta što označava kraj titracije. Količina utrošenog DCIP
preračunava se na mg AK/100 g uzorka.
Slika 30. Strukturne formule askorbinske kiseline

(lijevo) i dehidroaskorbinske kiseline (desno)
72
4mgAK
faktor DCIP =
mL DCIP
Izračun sadržaja vitamina C se dobije prema sljedećoj jednadžbi:
Sadržaj C vit (mg AK/100 g uzorka) = mg AK u alikvotu x Faktor DCIP x 2 x 100
Rezultati
73
4.5. ZAŠTITNO DJELOVANJE ŠEĆERA PRI NISKIM TEMPERATURAMA
Uvod u vježbu
Na temperaturama ispod 0°C životna aktivnost je jako umanjena te prestaje na oko -10°C.
Međutim, neke biljke bez većih posljedica na kasniji rast i razvoj mogu prezimiti i puno niže
temperature zraka. Dugotrajno djelovanje niskih temperatura, ili naglo spuštanje temperatura
ispod 0°C imaju za posljedicu narušavanje vodnog režima biljke, narušavanje staničnih
fizioloških procesa, narušavanje proteinsko pigmentskih struktura, a mogu se pojaviti i
mehanička oštećenja membrana kristalićima leda. Biljni organizam koji nepripremljen ulazi u
hladan period tokom rasta, često zbog navedenih posljedica smrzavanja odumire ili se
narušavanje fiziološko-biokemijskih procesa odražava na kasnije etape rasta i razvoja. Građa
protoplazme narušava se djelovanjem niskih temperatura te iz staničnog soka obojenih biljnih
tkiva izlaze pigmenti, koji specifično bojaju otopinu u koju je biljno tkivo potopljeno.
Cilj
Dokazati da šećeri štite stanicu od pucanja membrana biljnog tkiva izloženog djelovanju
niskih temperatura.
Materijal
pribor i oprema:
skalpel, epruvete, gumeni čepovi, tikvice od 100 mL, pinceta
biljni materijal:
list crvenog kupusa ili lisna drška cikle
reagensi:
0,5 M i 1 M otopina saharoze; smjesa za hlađenje (led u koji se dodaje 33g NaCl na 100 g leda
ili 59 g NaNO3 na 100 g leda)

Pripremi se 100 mL 1 M i 0.5 M otopine saharoze. Skalpelom ili žiletom se odreže površinski
sloj stanica lista crvenog kupusa ili lisne drške cikle, (oko 25 mm2). Bitno je da sloj odrezanih
stanica bude što tanji. Priređeni preparati stave se u tri epruvete napunjene s 8 mL destilirane
vode, odnosno 0.5 M ili 1.0 M otopinom saharoze i zatvore čepovima. Sadržaj otopine u
epruvetama zamrzava se pomoću smjese za hlađenje na temperaturi oko -20°C. Nakon 20-ak
minuta zamrzavanja, epruvete se stave u posudu s vodom gdje se otapa zaleđeni sadržaj
epruveta. Preparati se vade iz otopine (ili se otopina filtrira kroz filter papir) i promatraju
morfološke promjene stanica i promjene u boji tkiva i otopine.
74
Detaljno opiši morfološke i fiziološke promjene koje su se dogodile na ispitivanim uzorcima
uslijed izloženosti niskim temperaturama tj. smrzavanju.
Potrebno je zaključiti preko kojih se staničnih fizioloških procesa, a koji se odnose na

usvajanje i otpuštanje vode, manifestira zaštitna uloga šećer
75
4.6. AKTIVNOST ENZIMA KATALAZE
Uvod u vježbu
Katalaza (EC 1.11.1.6, H2O2:H2O2 oksidoreduktaza) je enzim pronađen u biljkama,
životinjama i aerobnim mikroorganizmima gdje katalizira brzu razgradnju vodikova
peroksida. Unutar stanice katalaze ima dosta u peroksisomima i katalitički je vrlo aktivna.
Biljne su katalaze tetramerni enzimi, molekulske mase od 54 do 59 kDa te sadrže hem kao
prostetičku skupinu. Ovaj enzim pokazuje dvojnu katalitičku aktivnost, katalaznu i
peroksidaznu. Pri katalaznoj aktivnosti enzim katalizira razgradnju vodikova peroksid na vodu
i kisik:
2H2O2 → 2H2O + O2
dok pri peroksidaznoj aktivnosti enzim katalizira oksidaciju supstrata (metanol, etanol,
formaldehid, nitrit ili elementarna živa) pri čemu nastaje voda:
supstrat + 2H2O2 → oksidirani supstrat + 2H2O
Velika važnost brze katalize vodikova peroksida potrebna je stoga jer je on snažan i jako
reaktivan oksidans koji može oštetiti biološke molekule i time uzrokovati metaboličke
poremećaje. Vodikov peroksid nastaje kao produkt u mnogim reakcijama procesa fotosinteze i
staničnog disanja (slika 31), a javlja se i kao produkt djelovanja oksidaza kao što su primjerice
glukoza oksidaza, NADPH oksidaza i razne aminokiselinske oksidaze.
Slika 31. Glavni izvori vodikova peroksida tijekom fotosinteze u C3 biljkama.

CLK, ciklus limunske kiseline; SOD, superoksid dismutaza; PSI, fotosustav I;
PSII, fotosustav II. ( Preuzeto iz I. Ślesak et al.ref)
76
Određivanja aktivnosti katalaze
Aktivnost katalaze određuje se u inkubacijskoj smjesi sastavljenoj od pufera, supstrata i
enzimskog ekstrakta. Inkubacija se vrši pri sobnoj temperaturi u vremenu do 30 minuta
nakon čega se reakcija prekida. Uz svaki uzorak-probu radi se slijepa proba koja sadrži pufer i
enzimski ekstrakt koji je prethodno zagrijan do ključanja. Nakon prekida inkubacije vodikov
peroksid koji nije izreagirao titrira se sa standardnom otopinom kalijeva permanganata (1).
Preko utroška otopine kalijeva permanganata za titraciju slijepe probe i probe, koristeći
formulu (2) dobiva se količina vodikova peroksida koji je tijekom inkubacije razgrađen
katalazom, a koristeći formulu (3) dobiva se aktivnost katalaze izražena kao količina
razgrađenog vodikova peroksida po jedinici vremena i volumena enzimskog ekstrakta.
5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 → 2MnSO4 + 2KHSO4 + 5O2 + 8H2O (1)
(VS-VP) x 50 [µmol] (2)
(VS-VP) x 50 / t x 10 [µmol min-1 mL-1] (3)
VP [mL] - volumen utrošenog KMnO4 za titraciju probe (P)

VS [mL] - volumen utrošenog KMnO4 za titraciju slijepe probe (S)
t [min] - vrijeme inkubacije u minutama
10 [mL] - volumen enzimskog ekstrakta u mililitrima
50 – µmoli vodikova peroksida ekvivalentni s 1 mL 0,02 M KMnO4
Cilj
Upoznati se s metodom određivanja aktivnosti katalaze. Ispitati kako vrijeme inkubacije utječe
na aktivnost enzima. Prirediti enzimski ekstrakt i inkubacijske smjese te izračunati aktivnost
katalaze.
Materijal
pribor i oprema:
8 Erlenmeyerovih tikvica, laboratorijska čaša od 500mL, pipete od 1, 5 i 10 mL, kuhinjski
nož, ribež, filter-papir, gaza, sat, centrifuga
biljni materijal:
gomolj krumpira
reagensi:
0,02 M otopina KMnO4; 5 %-tna otopina H2SO4; ekstrakt katalaze iz biljnog tkiva (gomolj
krumpira); 0,05M otopina fosfatnog pufera (pH = 7,0); 0,5 %-tna otopina H2O2 u 0,05M
fosfatnom puferu (pH = 7,0)
77
1. Priprema enzimskog ekstrakta

Odvagati 100 grama gomolja krumpira, nožem ili pomoću ribeža usitniti ga na manje komade
i prenijeti u laboratorijska čašu. Usitnjeni materijal homogenizirati miješanjem uz dodatak 100
mL hladnog fosfatnog pufera. Ovako pripremljen homogenat ostaviti u hladnjaku 30 minuta.
Nakon ekstrakcije, sadržaj procijediti preko gaze i profiltrirati kroz filter papir ili centrifugirati
pri 5000 G, 10 minuta na 4°C. Dobiveni filtrat (sirovi enzimski ekstrakt) koristiti za
određivanje aktivnost katalaze. Za potrebe slijepe probe 50 mL enzimskog ekstrakta zagrijati
do ključanja i ohladiti na sobnu temperaturu prije upotrebe.
2. Određivanje aktivnosti
Pripremiti uzorke prema tablici 6.
Tablica 6. Prikaz redosljeda dodavanja i količine reagensa u uzorak

Uzorak
Reagensi (mL) S1 P1 S2 P2 S3 P3 S4 P4
0,05M fosfatni pufer 10 10 10 10 10 10 10 10
Enzimski ekstrakt - 10 - 10 - 10 - 10
Prokuhani enzimski ekstrakt 10 - 10 - 10 - 10 -
0,5 %-tna otopina H2O2 5 5 5 5 5 5 5 5
Inkubacija 22oC (min) (5) (10) (15) (30)
Nakon proteklog vremena inkubacije, u tikvicu s uzorkom odmah dodati 5 mL 5% otopine

H2SO4 i promućkati. Dobiveni sadržaj potom titrirati otopinom KMnO4 do nastanka svijetlo
ljubičaste boje titrirane otopine. Izračunati količinu razgrađenog vodikova peroksida, a
aktivnost katalaze izraziti kao količinu razgrađenog vodikova peroksida po jedinici vremena i
volumena enzimskog ekstrakta.
Problemski zadaci:
1. Utječe li vremenski tijek reakcije na aktivnost katalaze? Objasnite.

2. Koja je uloga fosfatnog pufera u inkubacijskoj smjesi ?
3. Gubi li katalaza svoju aktivnost zagrijavanjem ?
4. Kako bi ste dobili aktivnost katalaze izraženu u količini razgrađenog vodikova peroksida
po gramu biljnog materijala?
5. Što je specifična enzimska aktivnost? Možete li je izraziti za katalazu u našem slučaju.
78

Praktikum Fiziologije Bilja

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Praktikum Fiziologije Bilja

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

PRAKTIKUM IZ

Poljoprivredni fakultet u Osijeku, 2009.

Miroslav Lisjak, dipl. inž.

1.1. ODREĐIVANJE KLOROPLASTNIH PIGMENATA

-C=C- , -C=N- , -N=N- , -N=O- , -C=S-.

U fotosintetskom aparatu viših biljaka najznačajniji su klorofili i karotenoidi. Dosada poznati

Način izvođenja vježbe

Dobivene vrijednosti apsorpcije (A662, A644 i A440) uvrštavaju se u Holm-Wetstteinove

klorofil a = 9,784 × A662 – 0,990 × A644 [mg/dm3]

Brojevi u jednadžbama su molarni apsorpcijski koeficijenti po Holmu i Wetstteinu. Formula

Zbog značajnosti koncentracije i odnosa pojedinih pigmenata, računa se odnos klorofila a i

Dobivene vrijednosti koncentracije pigmenata i omjeri kl a/b i kl/kar

Način izvođenja vježbe

Navedeno razdvajanje pigmenata može se obaviti i na klorofil a

Prema tome, kemijska metoda određivanja intenziteta fotosinteze zasniva se na određivanju

Način izvođenja vježbe

Za preračunavanje rezultata intenziteta u mg CO2/dm2 množi se s faktorom 44/12, što

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2822 kJ

Stoga se protočna metoda mjerenja intenziteta disanja zasniva na određivanju oslobođenog

Način izvođenja vježbe

1. plinska ispiralica komora 2. plinska ispiralica

Slika 6. Shematski prikaz aparature potrebne za pokus mjerenja intenziteta disanja

2KOH + CO2 → K2CO3 + H2O

KOH + HCl → KCl + H2O

KHCO3 + HCl → KCl + H2O

Formula za izračunavanje disanja:

X[mg CO2/h/kg] = a × 2 × (vp/vt) × 2,2 × (1000/m)

a [mL] - utrošak 0.1 M HCl u drugoj titraciji

K2CO3 + 2HCl → CO2 + H2O + 2KCl

vp[mL] - volumen predloška 0.5 M KOH prije početka pokusa (100mL)

2,2 - 1 mL 0.1 M HCl veže 2,2 mg CO2

Način izvođenja vježbe

*PBS (Phosphate buffer saline)

Način izvođenja vježbe

Tablica 1. Priprema standarda otopine BSA

Oznaka odmjerne tikvice → So S5 S10 S20 S40 S60 S100

Potrebno je izračunati koncentracije BSA u svakom pojedinom standardu i podatke upisati u

Način izvođenja vježbe

Ukupne kiseline (kiselost, mmol/100 g ploda) = (250/m) * V1 * C * (100/V0)

V0 [mL] - volumen uzorka

Način izvođenja vježbe

Sadržaj reducirajućih šećera (prirodnog inverta) = X * 100 / mg uzorka u alikvotu

Tablica 2. Vrijednosti prema Luff-Schoorlovom reagensu:

Način izvođenja vježbe

Formula za izračun ukupnog sadržaja antocijanina:

ANT[mg/kg] - sadržaj antocijanina u mg po kg svježe mase biljnog tkiva

R. Lo Scalzo, A. Genna, F. Branca, M. Chedin and H. Chassaigne (2008): Anthocyanin composition of

2.1. RAZARANJE I ANALIZA ELEMENTARNOG SASTAVA BILJNE TVARI

Mokro spaljivanje (II. metoda):

Slika 12. Mikrovalna peć za razaranje

Određivanje koncentracije mineralnih elemenata AAS-om i ICPS-om:

X[µg/g] - koncentracija ispitivanog elementa u uzorku suhe tvari biljke

Način izvođenja vježbe

Način izvođenja vježbe

Postotak dušika u uzorku računa se po formuli:

V [mL] - volumen utrošene 0,25 M H2SO4 za titraciju otopine iz predloška do pH 4,6

Način izvođenja vježbe

Vrsta povrća Odvaga Dodatak vode Konačni volumen Faktor

Prije mjerenja koncentracije nitrata potrebno je kalibrirati instrument Reflectoquant.

Sadržaj nitrata u ______________________________ je ________________________.

Način izvođenja vježbe

µg NO2/g/24 h]= c(NO2)*15*24

X[µg NO2/g/24 h] - aktivnost nitrat reduktaze

Sadržaj nitrata u ______ je .

µg NO2/g/24 h]= c(NO2)1524