P. 1
praktikum_fiziologije_bilja

praktikum_fiziologije_bilja

|Views: 493|Likes:
Published by Anonymous mKdAfWif

More info:

Published by: Anonymous mKdAfWif on Apr 14, 2011
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

06/30/2013

pdf

text

original

PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE BILJA

Poljoprivredni fakultet u Osijeku, 2009.

Miroslav Lisjak, dipl. inž. Marija Špoljarević, prof. Dejan Agić, prof. dr.sc. Luka Andrić

SADRŽAJ
1. 1.1. 1.1.A 1.1.B 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.5.A 1.6. 1.7. 1.8. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.3.A 3.3.B 3.4. 3.4.A 3.4.B 3.4.C 3.4.D 3.5. 3.6. 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. METABOLIZAM BILJAKA Određivanje kloroplastnih pigmenata................................................................................. Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije pigmenata po Holmu i Wetstteinu......... Razdvajanje pigmenata kromatografijom na papiru........................................................... Određivanje intenziteta fotosinteze kemijskom metodom................................................. Mjerenje intenziteta disanja protočnom metodom............................................................. Izolacija proteina iz biljnog materijala............................................................................... Određivanje koncentracije proteina................................................................................... Određivanje koncentracije proteina Lowry metodom........................................................ Sadržaj ukupnih kiselina u voću......................................................................................... Određivanje sadržaja reducirajućih šećera u plodovima.................................................... Spektroskopsko određivanje ukupnih antocijanina po metodi ekstrakcije uz različit pH.. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA Razaranje i analiza elementarnog sastava biljne tvari........................................................ Određivanje koncentracije fosfora u suhoj tvari biljaka..................................................... Određivanje koncentracije dušika u biljnom materijalu..................................................... Određivanje sadržaja nitrata u svježem povrću.................................................................. Određivanje aktivnosti nitrat reduktaze.............................................................................. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA Život rezanog cvijeća u vazi............................................................................................... Mjerenje površine lista........................................................................................................ Nastijska gibanja................................................................................................................. Termonastije........................................................................................................................ Fotonastije........................................................................................................................... Klijavost i vigor sjemena.................................................................................................... Standardna klijavost i energija klijanja sjemena................................................................. Cold test.............................................................................................................................. Električni konduktivitet sjemena........................................................................................ Zdravstveno stanje sjemena................................................................................................ Analiza rasta biljaka............................................................................................................ Utvrđivanje alelopatskih odnosa u klijanju......................................................................... FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA Određivanje deficita difuznog pritiska (DDP).................................................................... Određivanje evapotranspiracije lista................................................................................... Određivanje sadržaja prolina.............................................................................................. Određivanje sadržaja vitamina C........................................................................................ Zaštitno djelovanje šećera pri niskim temperaturama......................................................... Aktivnost enzima katalaze..................................................................................................

1. 3. 5. 7. 9. 12. 14. 16. 18. 20. 22. 24. 28. 30. 32. 35. 37. 40. 42. 43. 44. 46. 46. 50. 52. 54. 57. 61. 63. 68. 70. 72. 74. 76.

1. METABOLIZAM BILJAKA
1.1. ODREĐIVANJE KLOROPLASTNIH PIGMENATA

Uvod u vježbu Osnovna uloga kloroplastnih pigmenata, posebno klorofila, je apsorpcija svjetlosne energije koja se zatim procesima fotosinteze transformira u kemijsku energiju. Pigmenti fotoreceptori su obično obojeni, kompleksni organski spojevi čije se optičke osobine zasnivaju na kemijskoj strukturi njihovih molekula. Apsorpcija vidljivog dijela spektra, a s tim u vezi i boja pigmenata, zavisi o prisustvu sistema konjugiranih dvostrukih veza u njihovim molekulama: -C=C- , -C=N- , -N=N- , -N=O- , -C=S-. U fotosintetskom aparatu viših biljaka najznačajniji su klorofili i karotenoidi. Dosada poznati klorofili su -a, -b, -c, -d i -e, a više biljke sadrže klorofil -a (C55H72O5N4Mg) i klorofil -b (C55H70O6N4Mg) koji se nalaze u tilakoidima kloroplasta (slika 1). Klorofili su esteri dikarbonske kiseline klorofilina i alkohola fitola. Osnovna građevna jedinica je porfirinski prsten u čijem je središtu atom Mg vezan na N četiriju pirolovih prstena s dvije kovalentne i dvije koordinatne veze. Na porfirinsku jezgru vezan je fitolni rep bogat –CH3 skupinama, slika 1. Porfirinska jezgra je hidrofilna a fitolni rep je hidrofoban i lipofilan. Pri osvjetljavanju klorofila dolazi do ekscitiranja elektrona i stvaranja transportnog lanca elektrona kojim se usvojena svjetlosna energija prenosi do određenih akceptora koji dalje omogućuju korištenje te energije u tamnoj fazi fotosinteze. Modrozeleni klorofil a i žutozeleni klorofil b apsorbiraju vidljivi dio spektra i imaju maksimume apsorpcije u crvenom (600-700 nm) i plavom (400-500 nm) dijelu spektra. Njihov kvantitativni odnos u većine biljaka je otprilike 3:1. Karotenoidi (provitamini A) su narančasto-žuti pigmenti koji su po kemijskoj strukturi derivati izoprena (8 izoprenskih jedinica), a mogu biti aciklični, monociklični i Slika 1. Strukturna formula klorofila a i klorofila b; biciklični. Dijele se na karotene i prostorni izgled klorofila b (gore desno) ksantofile. Karoteni su žutonarančaste boje, a ksantofili imaju kisik u hidroksiketo- ili metoksi- grupi i žute su boje. Najpoznatiji karoteni su β-karoten (slika 2.) i likopen. Poznati ksantofili su: lutein, neoksantin, astaksantin, violaksantin i zeaksantin. Uloga im je dvostruka: prijenos energije na klorofil čime se proširuje spektar apsorpcije svjetlosti i zaštita fotolabilnog fotosintetskog aparata od oksidativne destrukcije. 1

Slika 2. Strukturna formula β karotena ( preuzeto s http://www.kii2.ntf.uni-lj.si/ekemija/file.php/1/output/barvila3/index.html )

2

magnezijev karbonat (MgCO3). Smjesa lista i dodanih kemikalija izmacerira se tučkom u tarioniku. Put kretanja zrake svijetlosti od emisijske lampe preko zrcala i uzorka do detektora (desno) 3 . te se macerat kvantitativno prenosi acetonom na guč postavljen na epruvetu umetnutu u vakuum bocu. b i karotenoida) u acetonskom ekstraktu biljnog materijala te preračunati koncentracije na mg/g svježe tvari. Odvaže se uzorak lista mase 0.2 g i prenese u tarionik (mogu se koristiti i kružni isječci poznate površine).1 g svježe tvari lista ili narezani listovi odgovarajuće površine) reagensi: aceton. Slika 3. filtrat se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25 mL. Nakon što se macerat profiltrira vakuum pumpom uz ispiranje guča acetonom. koja se nadopunjuje do oznake acetonom. spektrofotometar. Spektrofotometrom (slika 3) se očitava transmisija u dobivenom filtratu na 662. žlica.A SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PIGMENATA PO HOLMU I WETSTTEINU Cilj Odrediti koncentraciju kloroplastnih pigmenata (klorofila a. malo praha MgCO3 (na vrh noža) radi neutralizacije kiselosti i 10-ak mL acetona. Materijal pribor i oprema: vaga. guč br. 644 i 440 nm koristeći aceton kao slijepu probu (transmisija (T) = 100). klorofila b. vakuum pumpa na vodeni mlaz.1. 3 ili 4. odmjerna tikvica od 25 mL. kvarcni pijesak Način izvođenja vježbe Postupak ekstrakcije i određivanja pigmenata treba izvoditi brzo.1 g ili 0. bušač za čepove poznatog promjera (prema potrebi). epruvete na stalcima. Spektrofotometar (lijevo). u zamračenim uvjetima ili uz difuznu svjetlost zbog fotosenzibilnosti pigmenata. menzura od 10 mL biljni materijal: listovi veće površine (0. ukupnih klorofila -a. škare.1. tarionik i tučak. vakuum boca. Na uzorak se dodaje oko pola žličice kvarcnog pijeska.

Formula za izračun koncentracije pigmenata na mg/g svježe tvari lista (SvT): c = c1 × v × r m c [mg/g] .masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po gramu svježe tvari lista c1 [mg/dm3] .logT Dobivene vrijednosti apsorpcije (A662.990 × A644 [mg/dm3] klorofil b = 21.volumen filtrata (tj. Vrijednosti treba upisati u tablicu. računa se odnos klorofila a i klorofila b. A644 i A440) uvrštavaju se u Holm-Wetstteinove jednadžbe za izračunavanje koncentracije pigmenata u mg/dm3: klorofil a = 9. te odnos njihovog zbroja i karotenoida.Očitana transmisija (T) preračunava se u apsorpciju (A) po jednadžbi: A = 2 .razrjeđenje filtrata m [mg] .695 × A440 – 0.426 × A644 – 4.784 × A662 – 0.134 × A662 + 20.masena koncentracija pigmenta izražena u miligramima po decimetru kubnom v [mL] .odvaga uzorka izražena u miligramima = 100 mg Zbog značajnosti koncentracije i odnosa pojedinih pigmenata.436 × A644 [mg/dm3] karotenoidi = 4. Rezultati Dobivene vrijednosti koncentracije pigmenata i omjeri kl a/b i kl/kar kl a kl b kl a+b kar kl a/b koncentracija omjeri u mg/dm3 pigmenata koncentracija u mg/g SvT kl/kar 4 .268 × (klorofil a+b) [mg/dm3] Brojevi u jednadžbama su molarni apsorpcijski koeficijenti po Holmu i Wetstteinu.65 × A662 [mg/dm3] klorofil a+b = 5. odmjerne tikvice) izražen u mililitrima = 25 mL r .

tankoslojna y kromatografija. Slabije topljive tvari u smjesi otapalo će sporije otopiti te samim time i prenijeti kraći dio puta. prenoseći bolje topljive tvari iz smjese dalje od starta. Mjesto na koje nanosimo uzorak naziva se start. Kod ovakve kromatografije otapalo se uspinje Slika 4. mikropipeta.2 mL ekstrakta pigmenata.A.B RAZDVAJANJE PIGMENATA KROMATOGRAFIJOM NA PAPIRU Uvod u vježbu Metoda odjeljivanja zasnovana na različitoj distribuciji smjese tvari koju razdvajamo između mobilne faze (otapala) i neke stacionarne faze fronta nazivamo kromatografija. ekstrakt pigmenata) između otapala kao tekuće mobilne faze (npr. plinska kromatografija… Kromatografija na papiru zasniva se na razdiobi x tvari koju razdjeljujemo (npr. Na donjem kraju trake grafitnom olovkom se označi startna linija (3 cm od donjeg ruba trake) i startno mjesto (jedno startno mjesto u sredini startne linije ili dva startna mjesta na istoj liniji s razmakom 2 cm). Na startno mjesto (ili mjesta) mikropipetom se nanosi 0.1. Tijekom navedenog vremena otapalorazdvajač se uzdiže po kromatografskoj traci i sobom 5 . Materijal pribor i oprema: kromatografski papir Whatman br. Ovisno o dvije faze između kojih dolazi do raspodjele smjese tvari koju razdjeljujemo kromatografija može biti na stupcu.1-0. kolona za razdvajanje biljni materijal: acetonski ekstrakt pigmenata (1 g svježe tvari lista ili 25 mL ekstrakta (vidi u vježbi 1. fen. Cilj Vizualno određivanje pigmenata na kromatografskom papiru. Traka kromatografskog papira s nanešenim ekstraktom uroni se donjim rubom u otapalo.1. a fronta je mjesto najveće udaljenosti mobilne faze tj. R= x/y. Brzina prolaska tvari po pločici proporcionalan je prevaljenom putu.45) Način izvođenja vježbe Razdvajanje pigmenata izvodi se uzlaznom kromatografskom tehnikom na kromatografskom papiru pomoću otapala koje služi kao razdvajač pigmenata.1. U kolonu za razdvajanje usipa se otapalorazdvajač tako da visina otapala u koloni bude oko 1 cm. O brzini prelaska tvari možemo zaključiti iz omjera prijeđenog puta tvari od starta (x) i udaljenosti fronte od starta (y). smjesa petroletera.1. a gornji kraj trake učvrsti se pomoću čepa i ostavi stajati 15-30 minuta na sobnoj temperaturi. acetona i n-propanola u omjeru 90:10:0. Teško topive tvari će s otapalom prevaliti najmanji dio puta. otapala od starta (slika 4). papir). Kromatografski papir se izreže u trake širine 3-5 cm u smjeru valjanja papira. acetona i n-propanola) i start stacionarne faze krutog adsorbensa (npr. Izračunati R za svaki pigment uočen na kromatografskom papiru nakon razvijanja. kromatografija na papiru.)) reagensi: otapalo-razdvajač (sastoji se od petroletera. Kromatografija na papiru uz papir zbog kapilarnih sila samog papira. ali postupno uz sušenje mrlje fenom tako da mrlja ne bude šira od 10 mm.

klorofil b – žuto-zelene boje. a najveća kružnica karotena. ksantofili – žute boje. Najmanja će biti kružnica klorofila b. Redoslijed pigmenata razdvojenih kromatografijom na papiru Rezultati 6 . karoteni – narančaste boje. 3. Otapalo se usipa u Petrijevu zdjelicu nešto manjeg promjera od kromatografskog papira. Redoslijed pigmenata od vrha do dna kromatografske trake je slijedeći (slika 5): 1. 2. karoten ksantofil klorofil a klorofil b linija nanošenja Slika 5. 4. Potrebno je izračunati R za svaki pojedini pigment razdijeljen na kromatografskom papiru. u otapalo se uroni vrh izrezane trake kružnog papira koji se položi na Petrijevu zdjelicu i poklopi se s drugom zdjelicom istog promjera. a zatim se od ruba do središta kruga izreže traka širine 1 cm koja će poslužiti za uranjanje u otapalo-razvijač. Navedeno razdvajanje pigmenata može se obaviti i na kružnom kromatografskom papiru (φ 150 mm) tako da se ekstrakt pigmenata nanese u središte papira. klorofil a – zatvoreno-zelene boje.nosi pigmente koji se razdvajaju i ostaju grupirani na 4 različite razine od dna kolone. Nakon razdvajanja pigmenti će opisivati oko središta papira 4 kružnice (ili elipse) različitih boja.

reakcija procesa fotosinteze može se prikazati sljedećom jednadžbom: svjetlost nCO2 + nH2O (CH2O)n + nO2 Prema tome.067 M K2Cr2O7 i na vrh noža Ag2SO4. Metoda se temelji na razaranju organske tvari biljke jakim oksidansom do CO2 pri čemu je utrošak oksidacijskog sredstva mjera za određivanje količine ugljika. Potom se titrira sa 0. magnetna miješalica. difenilamin indikator. Pojednostavljeno.2. Kao slijepu probu u drugu Erlenmeyer tikvicu bez biljnog materijala dodaje se 10 mL 0. ODREĐIVANJE INTENZITETA FOTOSINTEZE KEMIJSKOM METODOM Uvod u vježbu Gledano sa kemijskog aspekta fotosinteza predstavlja niz reakcija oksidacije i redukcije u kojima se pomoću svjetlosne energije iz niskomolekularnih organskih spojeva (vode i ugljikovog(IV) oksida) u zelenima biljkama sintetizira organska tvar (ugljikohidrati). kemijska metoda određivanja intenziteta fotosinteze zasniva se na određivanju asimilirane količine ugljika u određenom vremenskom intervalu. 2 Erlenmeyer tikvice od 100 mL. sadržaj iz tikvica se kvantitativno prenosi u čaše od 500 mL sa 300-350 mL destilirane vode. pa se preporučuje titrirati iznad izvora svjetlosti. pipeta od 10 mL. Mohrova sol (0. analizu treba 7 .1 M FeSO4(NH4)2SO4×6H2O). električno kuhalo. U svaku čašu dodaje se 2 mL smjese sumporne i fosforne kiseline.067 M K2Cr2O7 i na vrh noža Ag2SO4. smjesa conc. čaše od 500 mL. Tikvice se zatvore staklenim lijevcima ili zračnim hladilom.1. iz koje se kasnijim procesima resinteze sintetiziraju ostali organski spojevi. 2 staklena lijevka (φ 6 cm). kružni bušači biljni materijal: biljka u punoj fotosintetskoj aktivnosti reagensi: 0. Materijal pribor i oprema: vaga. Ljubičasta boja obično je vidljiva malo prije točke ekvivalencije. sulfatnu kiselinu (H2SO4). Pipetom se dodaje 10 mL 0. sulfatne kiseline (H2SO4) i fosfatna kiselina (H3PO4) u omjeru 1:1.067 M kalijev dikromat (K2Cr2O7) u conc. ako je utrošak Mohrove soli u titraciji slijepe probe manji od 20 mL. Nakon hlađenja. Razlika u količini ugljika između dva mjerenja tijekom određenog vremenskog intervala preračunava se u intenzitet fotosinteze izražen u mg CO2/dm2/h. te 10-15 kapi difenilamin indikatora. bireta. Zapiše se utrošak Mohrove soli u titraciji.1 M Mohrovom soli do prelaska ljubičaste boje u zelenu. Cilj Određivanje intenziteta fotosinteze analizom asimilirane količine ugljika po lisnoj površini u jedinici vremena. te istovremeno zagrijavaju sve tikvice s uzorcima (ili slijepom probom) do ključanja i ostave se da ključaju 5 minuta (istovremeno zagrijavanje neophodno je zbog termičke nestabilnosti K2Cr2O7). srebrov(II) sulfat (Ag2SO4) Način izvođenja vježbe Izbuše se kružni isječci lista fotosintetski aktivne biljke (4 isječka φ 8-10 mm) i prenesu u Erlenmeyer tikvicu od 100 mL.

faktor za preračunavanje cm2 u dm2 S [cm2] .3×100 S a [mL] .faktor preračunavanja za odgovarajuću količinu ugljika 100 .utrošak Mohrove soli za titraciju slijepe probe b [mL] .ponoviti s manjom količinom organske tvari jer je premalo oksidansa u prethodno izvršenoj analizi.utrošak Mohrove soli za titraciju uzorka 0. što predstavlja omjer molarne mase CO2 i atomske mase ugljika. Formula za izračun intenziteta fotosinteze: X mgC/dm2 = [ ] (a − b) × 0.3 .površina isječaka lista uzetih za analizu Za preračunavanje rezultata intenziteta u mg CO2/dm2 množi se s faktorom 44/12. Rezultati 8 .

NADPH. saharoza i drugi šećeri. Dovodna cijev u obje plinske ispiralice mora se uroniti u otopinu (40 % NaOH u prvoj. Cilj Utvrđivanje intenziteta disanja analizom oslobođenog CO2 po jedinici mase supstrata u određenom vremenskom intervalu. Materijal pribor i oprema: vaga. plinska ispiralica Slika 6. lipidi. fenolftalein. FADH2 i kao toplinska energija koja se u manjem postotku zadržava u biljci te stimulira stanične procese a u većem postotku oslobađa u atmosferu ili tlo. MJERENJE INTENZITETA DISANJA PROTOČNOM METODOM Uvod u vježbu Svaka živa. električna vakuum crpka. metiloranž Način izvođenja vježbe zrak s CO2 zrak bez CO2 zrak s CO2 zrak bez CO2 CO2 izdvojen disanjem 1. titrator biljni materijal: klijanci (soje. 0. Uobičajeno disanje u kome se oksidira glukoza predstavlja se jednadžbom: C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O + 2822 kJ Stoga se protočna metoda mjerenja intenziteta disanja zasniva na određivanju oslobođenog ugljikovog(IV) oksida u određenom vremenskom intervalu. aktivna stanica kontinuirano diše usvajajući kisik i oslobađajući ugljikov(IV) oksid u jednakim količinama. 0. Shematski prikaz aparature potrebne za pokus mjerenja intenziteta disanja protočnom metodom Aparatura potrebna za mjerenje intenziteta disanja spoji se kao što prikazuje slika 6. pipeta od 10 mL. Potrebno je utvrditi da li plinska ispiralica s NaOH dobro pročišćava zrak od CO2. NADH. 100 g uzorka. kukuruza.5 M kalijev hidroksid (KOH). graha) ili svježa tvar lista reagensi: 40% natrijev hidroksid (NaOH).1. Kao supstrat za disanje može poslužiti škrob. staklena i gumena crijeva. 3 tikvice od 1000 mL sa čepovima. Energija se pohranjuje u energetski bogate spojeve poput ATP. suncokreta. a predložak s 100 mL 0. Erlenmeyer tikvica od 200 mL. organske kiseline i iznimno proteini.1 M kloridne kiseline (HCl). plinska ispiralica komora 2. a kisik reducira do vode uz oslobađanje kemijske energije. Disanje se može opisati kao proces oksidacije i redukcije organske tvari u kojem se supstrat oksidira do ugljikovog(IV) oksida.5 M 9 zrak s CO2 crpka .3.

8) i titrirati s 0. vrijedi: 1 dm3 1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.1 M HCl u drugoj titraciji 2 .2 × (1000/m) a [mL] .2 .2 mg CO2 1000 – za preračunavanje g u 1 kg m[g] .početna masa biljne tvari (100 g) 10 .utrošak 0. Za određivanje intenziteta disanja se u komoru (srednja posuda) stavi 100 g svježe naklijalog sjemena (ili svježe tvari lista).utrošak HCl iz druge titracije množi se s 2 jer je to pola reakcije neutralizacije nastalog K2CO3.1 M HCl dok se otopina ne obezboji.4. Zrak se provlači kroz cijelu aparaturu pomoću vakuuma kojeg stvara crpka i bilježi se trajanje pokusa (1 sat).KOH u drugoj plinskoj ispiralici). (otopina postaje narančasto-žuta) i nastavi titracija s HCl do točke neutralizacije (prelazak boje otopine u ružičastu) te se zabilježi utrošak 0.1 M HCl se iskoristi za dobivanje 0.5 M KOH prije početka pokusa (100mL) vt[mL] .1 M HCl. Zabilježi se utrošak HCl. KOH + HCl → KCl + H2O K2CO3 + HCl → KHCO3 + KCl Obezbojenom predlošku se doda nekoliko kapi metiloranža. Pri opisanoj titraciji se odvija neutralizacija preostalog KOH a istovremeno prevođenje K2CO3 u KHCO3.1 i 4.2 i 9. Nastali K2CO3 je dvobazna sol za čiju neutralizaciju se također utroši određena količina HCl-a pa je postupak pri titraciji slijedeći: Odpipetira se 20 mL predloška iz druge plinske ispiralice. dodaje nekoliko kapi indikatora fenolftaleina (otopina postaje ljubičasta.1 M HCl veže 2.volumen predloška 0. Reakcija neutralizacije je u ekvivalentnim količinama pa je za 10 mL 0. u predlošku nakon pokusa preostane i dio KOH. Pri tome se odvija slijedeća reakcija: 2KOH + CO2 → K2CO3 + H2O Pošto u zraku nema dovoljno CO2 za potpunu neutralizaciju KOH.volumen predloška odpipetiran za titraciju (20 mL) 2. pH između 8. a H2CO3 dvobazna kiselina.5 M CO2 = 22 g CO2 1 cm3 (mL) 0. KHCO3 + HCl → KCl + H2O Formula za izračunavanje disanja: X[mg CO2/h/kg] = a × 2 × (vp/vt) × 2.1 M HCl. Utrošak HCl za titraciju nakon provedenog pokusa će biti manji jer je jedan dio KOH neutraliziran vezivanjem CO2. komora se zamrači ako se ispituje fotosintetski aktivni dio biljke.5 M KOH potrebno utrošiti 50 mL 0.1 mL 0.05 mM CO2 = 2.2 mg CO2 budući da je HCl jednobazna. indikacija pH između 3. pa se ukupna reakcija može prikazati jednadžbom: K2CO3 + 2HCl → CO2 + H2O + 2KCl vp[mL] .

Rezultati 11 .

Dobar ekstrakcijski pufer trebao bi također biti primjenjiv s obzirom na različitu prisutnost velikog broja sekundarnih staničnih metabolita kako između biljnih tkiva (list.). cjelokupan se postupak uglavnom izvodi pri temperaturama između 0 i +4°C kako bi se spriječila denaturacija proteina. Pojam izolacije obuhvaća sve radnje kojima se koristimo prigodom prevođenja proteina iz njihova prirodnog okružja u otopinu. puferu se dodaje fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF) koji inhibira njihovu aktivnost. Iako je era proteomike donijela veća poboljšanja u pogledu primjene tehnika i metoda u izolaciji proteina. čime se sprječava razgradnja proteina. Cilj Upoznati se s biokemijskim metodama izolacije proteina.1. U posljednjem koraku izolacije proteina. Dodatak polivinilpolipirolidona (PVPP) ekstrakcijskom puferu također se često koristi za sprječavanje interakcije velikog broja fenolnih i polifenolnih spojeva s proteinima i time štiti njihova nativna struktura. Sljedeći postupak u izolaciji jest ekstrakcija proteina usitnjenog uzorka korištenjem pogodnog ekstrakcijskog pufera. Supernatant dobiven centrifugiranjem predstavlja sirovi ekstrakt proteina i služi za daljnju analizu i obradu. Kemijske metode kojima se uobičajeno koristimo za izolaciju organskih tvari ne mogu se primijeniti pri izolaciji proteina jer su oni osjetljivi na toplinu. homogenat se najčešće centrifugira radi odvajanja netopljivih dijelova stanica od otopine. Čest je postupak da se svježe biljno tkivo prelije tekućim dušikom i usitni trenjem u tarioniku. sjeme i plod) tako i između različitih biljnih vrsta. pročišćavanje proteina i sl. Prigodom izbora metode za izolaciju proteina iz biljnog tkiva susrećemo se s određenim problemima koje svakako moramo uzeti u obzir. određivanje koncentracije proteina.4. Kako se pri mehaničkom razbijanju uzorka razvija toplina. što predstavlja dodatni izazov pri njihovoj izolaciji. lužine. Unatoč velikoj raznovrsnosti količina proteina u biljnim tkivima relativno je niska. stabljika. Biljne stanice sadrže krutu staničnu stjenku pa je prvi korak u izolaciji razbijanje biljnog materijala radi izdvajanja staničnog sadržaja. Općenito se za pripremu sirovog ekstrakta biljnih proteina može upotrijebiti fosfatni ili Tris pufer određene pH vrijednosti i ionske jakosti. Pri usitnjavanju i homogeniziranju uzorka također se može upotrijebiti kvarcni pijesak ili drugo abrazivno sredstvo. mješača ili rezača. još nije moguće preporučiti jedinstvenu metodu kojom bi se izvršila izolacija svih proteina. kiseline. korijen. IZOLACIJA PROTEINA IZ BILJNOG MATERIJALA Uvod u vježbu Pored celuloze proteini čine glavne strukturne polimere biljnih stanica i tkiva. 12 . a neki su od njih navedeni u daljnjem tekstu. To se uglavnom postiže mehaničkim postupcima kojima se biljno tkivo usitnjava korištenjem različitih miksera. Prirediti sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala. Zbog prisutnosti uglavnom serinskih proteaza u uzorku biljnoga tkiva. organska otapala i zračenje. Pri izboru pufera treba obratiti posebnu pozornost na vrstu proteina i svrhu zbog koje se izolacija vrši (npr.

kvarcni pijesak biljni materijal: list biljke reagensi: PBS pufer (Phosphate buffer saline): priređuje se otapanjem 800 mg NaCl. stakleni lijevak. škarama ga usitniti na manje komade i prenijeti u tarionik (hlađen na ledu). O čemu ovisi izbor pH vrijednost ekstrakcijskog pufera ? 5. 20 mg KCl. 15 minuta na 4°C. Ovako pripremljen homogenat kvantitativno preliti u praznu kivetu za centrifugiranje i centrifugirati pri 5. škare. a zadnjom isprati tarionik). posuda s ledom. 140 mg Na2HPO4 i 24 mg KH2PO4 u 0.4. Kada je važno izolaciju proteina obavljati pri niskim temperaturama ? 3. Prije upotrebe podesiti puferu pH vrijednost na 7. centrifuga. pipeta od 5 mL.Materijal pribor i oprema: vaga. Usitnjeni materijal homogenizirati u tarioniku uz dodatak kvarcnoga pijeska i 2 mL hladnoga ekstrakcijskog pufera (pufer dodavati u 3 porcije. Koja je uloga ekstrakcijskog pufera pri izolaciji proteina ? 4. U koje svrhe koristimo izolaciju proteina ? 2. Kako bi ste u nedostatku centrifuge odvojili netopivi dio homogenata od otopine ? 13 . analitička vaga kiveta za centrifugiranje. Način izvođenja vježbe Priprema sirovog ekstrakta biljnih proteina: Odvagati 2 g biljnog materijala.000xg. *PBS (Phosphate buffer saline) Pitanja 1.1 L dH2O. tarionik. Dobiveni supernatant (sirovi ekstrakt) pažljivo dekantirati u čistu epruvetu i koristiti za određivanje koncentracije proteina Lowry metodom. biljni materijal.

Koncentracija se proteina određuje pri valnoj duljini od 750 nm. Najčešće korištene metode za određivanje koncentracije proteina u sirovom nepročišćenom ekstraktu jesu Biuret metoda. Metoda se temelji na pomaku apsorpcijskoga maksimuma slobodne boje Coomassie Brilliant Blue G-250 (slika 8) valne duljine 465 nm na 595 nm prilikom njezina vezanja na protein.5. Metoda je prikladna za analizu otopina proteina u koncentracijama između 1. Naziv je dobila po kondenzacijskom produktu dviju molekula uree . Kao standard koristi se protein koji je po sastavu jednak ili sličan proteinu koji se analizira. Ova je metoda osjetljivija u odnosu na prethodnu. Intenzitet nastale boje pod određenim uvjetima slijedi Lambert-Beerov zakon te je proporcionalan koncentraciji proteina.0 mg/mL.1. Osim što je točna i vrlo ponovljiva. Kompleks peptidnih veza i iona Cu2+ plavo-ljubičasto obojenje. Bradford metoda: Ova se metoda često koristi zbog jednostavne priprema reagensa. Metoda se temelji na osobini peptidne veze da u alkalnoj otopini tvori kompleks s ionima Cu2+. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA Uvod u vježbu Postoji više metoda i postupaka za određivanje koncentracije proteina. Nastali je kompleks ljubičaste boje s apsorpcijskim maksimumom pri 540 nm. Lowry metoda: Metoda kombinira reakciju bakrovih iona s peptidnim vezama u alkalnoj otopini (Biuret metoda) i reakciju redukcije Folin-Ciocalteau reagensa (smjesa molibdata i volframata) s fenolnom skupinom tirozina i triptofana dajuću Slika 7. Kod navedenih kolorimetrijskih metoda koncentracija proteina ovisna je o broju i sastavu aminokiselina. Pokazala se osobito praktičnom prigodom određivanja koncentracije proteina u sadržaju određene stanične frakcije kao i pri procjeni količine proteina potrebne za gel elektroforezu. slika 7. 14 . brzog razvijanja boje i niskoga praga osjetljivosti. Biuret metoda: Ovom se metodom prvenstveno dokazuje prisutnost peptidne veze. a prikladna je za određivanje proteina u koncentracijama između 0. glavna je prednost ove metode u tome što je manje osjetljiva na vrstu proteina koji se određuje. koji također daje pozitivnu reakciju. Lowry metoda i Bradford metoda. te ovakva mjerenja zahtijevaju primjenu standarda. kada se postiže maksimum apsorpcije reduciranog oblika Folin-Ciocalteau reagensa.0 i 10 mg/mL .01 i 1. a izbor metode može ovisiti o vrsti materijala i količini uzorka te koncentraciji proteina u uzorku. Određivanje koncentracije proteina ovim metodama temelji se na vezanju specifičnoga bojenog reagensa na molekulu proteina.biuretu. Donji prag osjetljivosti ove metode iznosi 0. Pritom dolazi do pomaka apsorpcijskoga maksimuma boje vezanog reagensa u odnosu na apsorpcijski maksimum boje nevezanog reagensa.5 µg/mL proteina.

Slika 8. Strukturna formula Coomassie Brilliant Blue G-250 15 .

S40. S20.1 mol/L NaOH. Za pripremu razrjeđenja standardne otopine BSA potrebno je odpipetirati količine navedene u tablici 1. S5. U svaku epruvetu potom dodaje se 5 mL alkalnog reagensa. Usporedno s pripremom standardnog niza. pipetira se po 1 mL otopine i dodaje u pripadnu epruvetu (oznaka S0. S20. Tablica 1. S60 i S100. S20. 8 epruveta. S100 i U. sadržaj se promućka i smjesa ostavi 15 minuta na sobnoj temperaturi. Iz svake odmjerne tikvice (oznaka S0. kolorimetar ili spektrofotometar biljni materijal: list biljke reagensi: Reagens A: 2% Na2CO3 u 0. Reagens B: 0. smjesa se dobro promućka i ostavi 15 min. S60 i S100). Alkalni reagens : priprema se miješanjem 50 mL reagensa A s 1mL reagensa B 2. S5. Prirediti standardni niz otopina.2 mg mL-1) mL dH2O Koncentracija BSA mg mL-1 So 0 100 S5 5 95 S10 10 90 S20 20 40 S40 40 60 S60 60 40 S100 100 0 Potrebno je izračunati koncentracije BSA u svakom pojedinom standardu i podatke upisati u posljednji red tablice.5% CuSO4 x 5H2O u 1% K Na-tartaratu 1 . pipete od 1. Materijal pribor i oprema: 7 odmjernih tikvica od 100 mL. S40. S10.5. S10. 16 . načinom izrade i uporabom baždarnoga dijagrama. Za baždarenje uređaja upotrjebljava se slijepa proba (epruveta s oznakom S0). S5. S10. 5. Folin-Ciocalteu reagens : kupovni reagens razrijediti destiliranom vodom u omjeru 1:1. 10 i 20 mL.A ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE PROTEINA LOWRY METODOM Cilj Upoznati se s kolorimetrijskom metodom određivanja koncentracije proteina Lowry metodom.5 mL Folin-Ciocalteau reagensa. S20. S5. S40. Za pripremu standardnog niza priprema se osam čistih epruveta te ih se označi: S0. S10. Sirovi ekstrakt proteina iz biljnog materijala (razrijeđen s dH2O u omjeru 1:100) Način izvođenja vježbe Potrebno je pripremiti sedam odmjernih tikvica od 100 mL i označiti ih: S0. Priprema standarda otopine BSA Oznaka odmjerne tikvice → mL BSA (0. iz odmjerne tikvice uzorka pipetira se 1 mL otopine i dodaje u praznu epruvetu s oznakom U. S60 i S100). Standardna otopina albumina goveđeg seruma (BSA) koncentracije 0. S40. na sobnoj temperaturi kako bi se razvila boja 3.2 mg/mL. izraditi baždarni dijagram i odrediti koncentraciju proteina. S60. Nakon razvijanja boje na kolorimetru (uz korištenje crvenog filtra) ili spektrofotometru (λ 750 nm) očitava se vrijednost apsorbancije za sadržaj svake epruvete standardnog niza i uzorka.1. Nakon 15 minuta u svaku epruvetu dodaje se 0. stakleni lijevak.

Pitanja: 1. Što je standardni niz ? 4. 17 . Kiseli Folin-Ciocalteau reagens je nestabilan u jako lužnatoj otopini (alkalni reagens) te se mora brzo dodati i dobro promućkati. Što bi ste učinili sa sirovim ekstraktom ukoliko ima nisku (kolorimetrijski nemjerljivu) koncentraciju proteina ? 1 2 3 Pripremiti svježu otopinu reagensa B Otopinu alkalnog reagensa pripremiti neposredno prije pipetiranja. Zašto kolorimetrijsko mjerenje koncentracije proteina zahtjeva upotrebu standarda ? 3. Zašto se u našem slučaju sirovi ekstrakt razrjeđuje prije mjerenja koncentracije proteina ? 5. Izračunati ukupnu količinu proteina u biljnom ekstraktu i rezultat izraziti u mg proteina po gramu svježega biljnog materijala.Rezultati Na osnovi dobivenih vrijednosti apsorbancije uzoraka standardnog niza i poznatih koncentracija BSA izraditi baždarni dijagram s pravcem. Na temelju kojeg zakona se vrši kolorimetrijsko određivanje koncentracije proteina ? 2. Vrijednost ekstinkcije uzorka (epruvetu s oznakom U) ucrtati na koordinatu baždarnoga dijagrama te preko baždarnoga pravca očitati koncentraciju proteina u uzorku.

bireta ili titrator. Određivanje kiselosti se vrši titracijom s otopinom NaOH. povratno hladilo. Sadržaj miješati na magnetnoj miješalici dok tekućina ne bude homogena.odvagana masa ploda za analizu 18 . SADRŽAJ UKUPNIH KISELINA U VOĆU Uvod u vježbu U pokazatelje kakvoće voća (plodova) ubraja se i ukupan sadržaj kiselina. vodom do oznake i promućkati. vodena kupelj. te nadopuniti s dest. Materijal pribor i oprema: pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom.volumen NaOH utrošen za titraciju C [mol/L] . filter-papir. jagode. te se izračuna sadržaj ukupnih kiselina. One se nalaze u voćnom soku kao slobodne ili u obliku soli. Tikvicu spojiti s povratnim hladilom i zagrijavati na vodenoj kupelji 30 min. Cilj Utvrditi sadržaj ukupnih kiselina u plodu voća. uz fenolftalein kao indikator. Kiselost voćnih plodova čine organske kiseline kao što su limunska ili jabučna. Filtrirati kroz naborani filter-papir u EM tikvicu od 250 mL. dodati 150 mL destilirane vode. vaga biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke. mmol/100 g ploda) = (250/m) * V1 * C * (100/V0) V0 [mL] .6. stakleni lijevak za filtriranje. Ukupne kiseline (kiselost. pipeta od 25 – 100 mL. grožđe i dr. odmjerne tikvice od 250 mL. Ovisno o očekivanoj kiselosti odpipetirati 25 . menzura do 250 mL.1.točna koncentracija otopine NaOH m [g].volumen uzorka V1 [mL] . fenolftalein Način izvođenja vježbe Odvagati 25 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu s brušenim grlom od 250 mL.) 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s brušenim grlom od 250 mL. 1 odmjerna tikvica od 250 mL. magnetna miješalica i stirer.) reagensi: 0. Volumen NaOH utrošenog za titraciju se zabilježi. do pojave svijetlo ružičaste boje u trajanju od najmanje 30 sek.100 mL u odgovarajuću EM tikvicu i titrirati s 0. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 250 mL. mikser ili sl. 1 Erlenmeyerova (EM) tikvica s neubrušenim grlom od 250 mL.1 M otopina natrijavog hidroksida (NaOH) poznatog faktora (točne koncentracije). uz fenolftalein kao indikator.1 M NaOH poznatog faktora.

): Skripta za vježbe iz kolegija: Kemija mediteranskog voća i tehnologija prerade. Katalinić. 19 . 45. I. V. Zavod za prehrambenu tehnologiju i biotehnologiju. Skroza.. (2009. Kemijsko-tehnološki fakultet Sveučilišta u Splitu.Rezultati Literatura Generalić. D.. Str.

3 Erlenmeyerove (EM) tikvice od 250.1 i 1 M otopina natrijevog hidroksida (NaOH). s 25 mL dest. Nakon toga titrirati s Na2S2O3 dok boja ne postane žuta. 0.) reagensi: 3 M otopina sulfatne kiseline (H2SO4). magnetna miješalica i stirer. Ohlađeno kvantitativno prenijeti u odmjernu tikvicu od 200 mL. vaga. vaga. bireta ili titrator. prema razlici utroška Na2S2O3 između slijepe probe i uzorka mg uzorka u alikvotu . kalcijev karbonat (CaCO3) Način izvođenja vježbe Odvagati 10 g usitnjenog i homogeniziranog uzorka ploda u EM tikvicu od 250 mL. te izračunati sadržaj reducirajućih šećera. Sadržaj reducirajućih šećera (prirodnog inverta) = X * 100 / mg uzorka u alikvotu X [mg] . kuhalo.).7. 0. Ostaviti da se istaloži nakon čega filtrirati u suhu EM tikvicu od 300 mL. nakon čega kuhati 10 min uz povratno hladilo.miligrami prirodnog inverta. koji imaju keto ili aldehidnu funkcionalne skupine. naborani filter-papir. 10 mL prethodno dobivenog filtrata uzorka i 15 mL dest. Dodati nekoliko mL otopine škroba i nastaviti titraciju do potpunog nestanka plave boje. dodati 100 mL destilirane vode. Paralelno treba raditi slijepu probu. Ohladiti pod vodenim mlazom. Volumen Na2S2O3 utrošenog za titraciju zabilježiti. U EM tikvicu od 500 mL odpipetirati 25 mL Luffove otopine. odgovarajuće pipete. povratno hladilo.1. kao što su glukoza i fruktoza te pentoze. staklene kuglice biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog ploda voća (jabuke. odmjerne tikvice 200 mL. Materijal pribor i oprema: pribor za maceraciju tkiva (keramički tarionik s tučkom. ODREĐIVANJE SADRŽAJA REDUCIRAJUĆIH ŠEĆERA U PLODOVIMA Uvod u vježbu Saharoza je disaharid čijom hidrolizom (inverzijom) nastaje jedna molekula glukoze i jedna molekula fruktoze. Luffov reagens. dodati 1-2 g CaCO3. vodena kupelj. 0. stakleni lijevak. 5 mL Carrez I i 5 mL Carrez II. 30% otopina kalijevog jodida (KJ). promiješati i grijati na vodenoj kupelji 10 -15 min.500 (ako se izvaže 10 g uzorka i razrijedi na 200 mL otopine te se uzme 10 ml alikvota) 20 . 0. te kao takva ne može reducirati Fehlingovu otopinu. Saharoza u svojoj molekuli nema slobodnu aldehidnu grupu. Dodati staklene kuglice i zagrijavati direktno na plamenu do vrenja.1 M otopina kloridne kiseline (HCl). 300 i 500 mL.1% otopina škroba. 30% otopina fenolftaleina. na čemu se zasniva metoda određivanja šećera. dodati 10 mL otopine KJ i oprezno 25 mL otopine H2SO4. vode umjesto filtrata iz plodova uzetih za analizu. koje se zajedničkim imenom nazivaju invertni šećeri. grožđe i dr. na azbestnoj mrežici. Cilj Utvrditi sadržaj reducirajućih šećera u plodu voća.1 M otopina natrijeva tiosulfata (Na2S2O3). vode. očitani iz tablice 2. nadopuniti s dH2O do oznake i promućkati. jagode. otopine Carrez I i Carrez II. Reducirajući šećeri su svi šećeri. mikser ili sl.

0 3.4 2.4 25.4 4.5 2.4 2.7 2.0 3.6 30.2 9.9 3.5 2.9 2.0 53.9 2.6 2.6 2. Vrijednosti prema Luff-Schoorlovom reagensu: 0.1 62.2 razlika 2.2 14.0 35.7 2.8 2.2 47.5 41.1 Literatura http://www.doc 21 .7 2.8 2.Rezultati Tablica 2.1 mol/l (Na2S2O3) ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Glukoza.0 59.3 33. invertni šećeri C6H12O6 (X)mg 2.hr/pdf/zakoni/Pravilnik_o_seceru_i_ostalim_saharidima_njihovim_otopinama_te_skrobu_i_skro bnim_sirupima_NN_174_04.2 19.0 56.5 2.7 17.6 2.mps.8 22.8 7.3 44.1 50.7 38.5 2.1 3.6 2.0 27. fruktoza.7 12.

8. Metoda se temelji na strukturalnoj razlici antocijanina pri različitoj pH vrijednosti medija (pri pH 1. pri pH 4. poput nedostatka dušika i fosfora. SPEKTROSKOPSKO ODREĐIVANJE UKUPNIH ANTOCIJANINA PO METODI EKSTRAKCIJE UZ RAZLIČIT pH Uvod u vježbu Crveno-ljubičasta boja biljnog tkiva (listovi. godina).1. korijen) kod različitih vrsta voća. Akumulacija antocijanina u vegetativnim dijelovima biljaka je često pokazatelj reakcije biljke na stres uvjetovan okolišnim činiteljima.0 su obojeni. peteljke. Slika 9. latice.5 bezbojni). dakle njihova antioksidacijska svojstva. slika 9. Također. Sinteza antocijanina u biljkama polazi od fenilalanina te je poznato više od 550 antocijanina (2006. plodovi. plodova i latica različitih biljnih vrsta Svojstvo obojenosti u velikoj mjeri utječe na prihvatljivost biljnih proizvoda od strane potrošača i njihovu tržišnu vrijednost. Analiza sastava antocijanina nije moguća bez HPLC i MS tehnike. 22 . akumuliranih u vakuolama stanica. cvijeća i ratarskih usjeva potječe uglavnom od grupe vodotopljivih flavonoidnih spojeva antocijanina. čine ih sve interesantnijim biljnim funkcionalnim komponentama. povrća. Specifično antocijansko obojenje listova. dok se njihov ukupan sadržaj može odrediti spektrofotometrijski na 510 nm te izraziti kao mg cijanidin-3-glukozid klorida u kg svježe mase biljnog tkiva. uslijed čega pokazuju različitu apsorpciju svjetlosti valne duljine 510 nm. potencijalna zdravstveno-promotivna svojstva antocijanina poput zaštite od slobodnih radikala.

ApH 4. M. var. F.K. Barnes. S.M. R. M. Giusti. D. Martinsen. Genna. Miller. spektrofotometar sa staklenim kivetama.5 – apsorpcija u uzorku s puferom II 484.. Wightman... S. K.C. 400 mL 1 M CH3COONa. Ryabkova. Lo Scalzo. Journal of AOAC International. Chassaigne (2008): Anthocyanin composition of cauliflower (Brassica oleracea L.. Chedin and H. plod i dr. B. plastične epruvete od 15 mL s čepom biljni materijal: uzorci svježeg ili zamrznutog biljnog tkiva (list. F. odgovarajuće pipete i odmjerne tikvice. Vol. U jednu se dodaje 10 mL pufera I a u drugu isti volumen pufera II.. 107(1): 136-144.0 (10 mL po uzorku. botrytis) and cabbage (B.. Koswig..2 M HCl)... A. capitata) and its stability in relation to thermal treatments.0 . Supernatanti se koriste za mjerenje apsorpcije na 510 nm. Martin. Kupina. oleracea L. Krueger. Durst. 88(5): 1269-1278. vortex. natural colorants. Nakon homogenizacije vorteksiranjem (10-tak sekundi).K. beverages. Skrede. pufer II: pH 4. A. R. T. latice. obje suspenzije se centrifugiraju dva puta po 15 minuta na 5000 G pri 4oC. (2005): Determination of total monomeric anthocyanin pigment content of fruit juices. centrifuga s hlađenjem.A. 23 . tekući dušik s priborom za maceraciju (keramički tarionik s tučkom).8/24 825) x 20 000 ANT[mg/kg] .2 M KCl i 375 mL 0. Haché. J. Paquette. G. Hofsommer. Wrolstad. Trenn. T. H. Eisele.. 240 mL 1 M HCl i 360 ml deionizirane H2O) Način izvođenja vježbe Nekoliko grama biljnog tkiva (3-5 g) se tekućim dušikom macerira do finog praha. J... koristeći čiste pufere kao slijepe probe.D. J. S..) reagensi: pufer I: pH 1... U.sadržaj antocijanina u mg po kg svježe mase biljnog tkiva ApH 1.. Vol.8 – molekularna masa cijanidin-3-glukozid klorida 24 825 – molarni apsorpcijski koeficijent cijanidin-3-glukozid klorida 20 000 – faktor za preračunavanje na mg/kg svježe mase Rezultati Literatura Lee.5 g u posebno označene dvije plastične epruvete od 15 mL.W.Materijal pribor i oprema: vaga.W. analitička vaga. nakon čega se odmah odvaže po 0.0 – apsorpcija u uzorku s puferom I ApH 4. 125 mL 0.. var.E. Formula za izračun ukupnog sadržaja antocijanina: ANT (mg/kg svježe mase) = (ApH 1. Branca. and wines by the pH differential method: Collaborative study.5) x (484. Food Chemistry. R..5 (10 mL po uzorku.

smjesa za razaranje (4% HClO4 u H2SO4) za razaranje u mikrovalnoj peći: conc. FIZIOLOGIJA MINERALNE ISHRANE BILJAKA 2. conc. svega oko 3%. filter-papir.. nitratna kiselina (HNO3). boca špricalica. Cilj Odrediti sadržaj mineralnih elemenata biljne ishrane. Cd. Zbog različitih koncentracija može se posebno pripremati osnovna otopina za analizu različitih elemenata (mikroelementi: Fe. Temelj kemijske analize mineralnog sastava biljne tvari čini priprema osnovne otopine uzorka (oksidacijom biljne tvari razaranjem ili spaljivanjem) i određivanja koncentracije elemenata u osnovnoj otopini. stakleni lijevci. Fe. Postoji više različitih načina razaranja biljne tvari. Zn. Mn. Mn. Mg. RAZARANJE I ANALIZA ELEMENTARNOG SASTAVA BILJNE TVARI Uvod u vježbu Mineralne tvari (biogeni mineralni elementi: P. Cu… i toksični elementi: Hg. K. Ca…). Cu.05 M H2SO4) za mokro spaljivanje na bloku: conc. biološke katalize. automatska pipeta od 10 mL (za razaranje u mikrovalnoj peći). prenošenje elektrona… Zbog toga su vrlo velikog fiziološkog i praktičnog značenja za biljku. nitratna kiselina (HNO3) 24 . Zn. vodikov peroksid (H2O2). Ca. 2 staklene pipete od 25 mL i propipeta (za razaranje na bloku).. teflonske za razaranje u mikrovalnoj peći). vodikov peroksid (H2O2).2.05 M HCl + 0. Materijal pribor i oprema: vaga. As… kojih ima u vrlo malim količinama s obzirom na zastupljenost mineralnih makroelemenata: P. B. Stupaju u različite fiziološke procese poput osmoregulacije. K. odmjerne tikvice od 100 ili 50 mL.) čine mali dio ukupne suhe tvari biljke. vrsti biljnog materijala i dostupnosti opreme. plastične bočice od 100 mL biljni materijal: osušeni samljeveni uzorak biljne tvari bilo kojeg dijela biljke reagensi: za suho spaljivanje: conc. kivete za razaranje (staklene za razaranje na bloku. aktivacije pojedinih enzima. koji se primjenjuju ovisno o elementima koje će biti analizirani. ekstrakcijska smjesa (0. S.1. Pb.

te se ohladi. 50 ili 100 mL ispirući Slika 11. Blok za razaranje deioniziranom vodom te se nadopuni istom vodom do oznake.05 M HCl + 0. U odmjernu tikvicu se doda 1 mL conc. H2O2 i stavi na blok za razaranje. Ako se iz matične otopine žele daljnjim analizama odrediti elementi u tragovima ili teški metali tada je prikladnije raditi po metodi razaranja mikrovalovima.05 M H2SO4) prenosi pepeo i istom smjesom dopuni do 100 mL. Ako uzorak nakon razaranja bude i dalje mutan prema potrebi se dodaje od 5-10 mL vodikovog peroksida i razara još dodatnih 20-30 min. poput selena. metoda): Na 1 do 2 g suhe biljne tvari doda se 5 mL smjese za razaranje (4% HClO4 u H2SO4). Peć za žarenje Mokro spaljivanje (II. zatim se u istu tikvicu ekstrakcijskom smjesom (0. Uzorak sa smjesom kiselina i vodikovim peroksidom se zagrijava na bloku za razaranje (slika 11) pri temperaturi od 340-360°C oko sat vremena (ovisno o vrsti razaranog biljnog materijala) do gubitka boje i potpunog razbistravanja. Ohlađeni uzorak se kvantitativno prenosi u odmjernu tikvicu od 25. jer se neki elementi.0 g suhe biljne tvari doda se 5 mL conc. Slika 10.0 g suhe biljne tvari zagrijava se 4 sata na 500°C u peći za žarenje (slika 10). H2SO4 te se zagrijava iznad plamenika do prestanka stvaranja bijele pare. HNO3 i 2 mL conc.Način izvođenja vježbi Suho spaljivanje: 1. prilikom razaranja na bloku gube isparavanjem već pri temperaturama od oko 200°C. 25 . Mokro spaljivanje: Na 1.05 M HCl + 0. Nakon toga uzorak se prelije sa 10 mL conc. Prilikom suhog spaljivanja mogućnost kontaminacije uzorka je veća kao i stvaranje teže topivih oksida željeza i mangana tijekom žarenja.05 M H2SO4). HNO3. stoga valja dati prednost metodi mokrog spaljivanja. Ohlađeni uzorak se u odmjernoj tikvici nadopuni do 100 mL smjesom kiselina (0.

ICPS analizator – plazma 26 . te prelije sa 8-10 mL koncentrirane HNO3 i 2-4 mL koncentriranog H2O2. Očitane vrijednosti koncentracije analiziranih elemenata nakon mjerenja. Kivete se hermetički zatvore i umetnu u za njih predviđeno kružno postolje koje se postavi u mikrovalnu peć (slika 12). Slika 12. Rezultati koje očitavamo s AAS-a ili ICPS-a izraženi su u µg/mL ili mg/L (prijašnje oznake ppm) i označavaju koncentraciju ispitivanog elementa u osnovnoj otopini. preračunavaju se u koncentraciju elemenata u µg/g ili g/kg suhe tvari biljke. Za mjerenje je potrebno pripremiti koncentracijski niz standardnih otopina poznatih koncentracija elemenata koje želimo analizirati. te njima kalibrirati AAS ili ICPS. slika 13) ili emisijskom tehnikom pomoću ICPS-a (plazme. Biljni materijal se razara pod tlakom od 180 psi u trajanju od 20 min. Slika 13. 50 ili 100 mL i nadopuni vodom (dH2O) do oznake.atomski adsorpcijski spektrofotometar Slika 14. slika 14). Mikrovalna peć za razaranje Određivanje koncentracije mineralnih elemenata AAS-om i ICPS-om: Koncentracije mineralnih elemenata u osnovnoj otopini određuju se apsorpcijskom i/ili emisijskom tehnikom pomoću AAS-a (atomskog apsorpcijskog spektrofotometra. AAS analizator .Razaranje mikrovalovima: U teflonske kivete odvaže se 1 g suhe biljne tvari. Ohlađeni uzorak se kvantitativno uz ispiranje deioniziranom vodom prelijeva u odmjerne tikvice od 25.

koncentracija ispitivanog elementa u uzorku suhe tvari biljke c [µg/mL] .volumen osnovne otopine m [g] .Formula za izračunavanje koncentracije mineralnih elemenata u analiziranom uzorku biljne tvari: X [µg / g ] = c∗v m X[µg/g] .masena koncentracija ispitivane otopine uzorka (očitanje s AAS-a) v [mL].odvaga suhe tvari biljke za analizu Rezultati 27 .

Cilj Odrediti koncentraciju fosfora u suhoj tvari biljnog materijala. odnosno preračunavanjem na odvagu suhe tvari uzorka uzetu za dobivanje matične otopine.1.4394 g KH2PO4 se otopi u 1 L destilirane vode. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE FOSFORA U SUHOJ TVARI BILJAKA Uvod u vježbu Biljke usvajaju fosfor iz tla najvećim dijelom kao jednovalentni fosfatni anion (H2PO4 -. 28 . doda 2.6 µg P/mL). Materijal pribor: spektrofotometar sa staklenim kivetama. Način izvođenja vježbe Priredi se serija standardnih otopina poznate koncentracije fosfora tako da se u odmjerne tikvice od 100 mL prenese 0. Za razliku od dušika i sumpora. gdje sudjeluje u obliku spojeva bogatih energijom poput ATP i sl. u % na suhu tvar analiziranog biljnog materijala. odgovarajuće pipete (110. Tikvice se začepe i promućkaju te ostave da se razvije boja tijekom 1 h u mraku.2. prethodno razorenog uz pomoć smjese kiselina i vodikovog peroksida. 3. odmjerne tikvice od 100 mL. Od matične otopine uzorka u kojem se određuje koncentracija fosfora pipetom se prenese 10 mL u odmjernu tikvicu od 100 mL. na temelju specifične apsorpcije svjetlosti (725 nm) u plavo obojenom fosfor-molibdatskom kompleksu. 0.8 mL koncentrirane sulfatne kiseline i dopuni do 100 mL destiliranom vodom). 11% natrij sulfit (Na2SO3). hidrogen fosfat). fosfor ne podliježe redukciji u biljkama već ostaje u obliku fosfata u slobodnom obliku ili organski vezan u esterima. 2. Nezamjenjiva uloga ovog makroelementa je u brojnim transformacijama tvari i energije u stanici. Fosfat je lako pokretljiv u biljnom organizmu. u sastavu je nukleotida koji čine DNA i RNA te fosfolipida u sastavu biomembrana. Određivanje koncentracije fosfora se u načelu vrši spektrofotometrijski. izračuna koncentracija fosfora u µg/mL otopine. po 1 mL natrijevog sulfita i hidrokinona i dopuni destiliranom vodom do 100 mL. U sve tikvice (standardi i uzorci) doda se oko 50 mL destilirane vode. esencijalan je dio fosfatiziranih šećera koji sudjeluju kao metaboliti u procesima fotosinteze.2. 4. dihidrogen fosfat) ili dvovalentni anion (HPO4 2-.) reagensi: 5% amonijev molibdat (5 g (NH4)6Mo7O24 x 4H2O se otopi u 80 mL destilirane vode. disanja i drugih metaboličkih procesa. 5 i 10 mL) biljni materijal: suha tvar biljaka (nadzemni dijelovi ili korijen) dobivena sušenjem na 105oC ili matična otopina uzorka biljne tvari razorena mokrim postupkom (pogledaj vježbu 2.5% hidrokinon. 5 mL amonijevog molibdata. 1. osnovni standard za fosfor (0. Nakon toga se spektrofotometrom mjeri apsorpcija na 725 nm te pomoću kalibracijskog dijagrama ili kompjuterskog programa za izračun koncentracije na temelju serije standarda. 5 i 6 mL osnovnog standarda (koncentracija 0 .

Postotak fosfora treba prema sljedećoj jednadžbi: (c * (100 ))*10−2 v %P = m c [µg/mL] .alikvot matične otopine (10 mL) m [g] .odvaga suhe tvari uzorka u 100 mL matične otopine Rezultati 29 .koncentracija P v [mL] .

25 M sulfatnom kiselinom (H2SO4). Vrijednost postotka dušika određuje se prema utrošku kiseline za titraciju po formuli koja je unesena u memoriju titratora.1. E) predložak.25M sulfatna kiselina (H2SO4) Način izvođenja vježbe Potrebno je pripremiti matičnu otopinu razorenog biljnog tkiva kojeg želimo upotrijebiti kao uzorak za određivanje koncentracije dušika (vidi vježbu 2. te titrator počinje sa titracijom otopine u predlošku s 0. 2% borna kiselina (H3BO3) pH 4. Cilj Odrediti postotak dušika u matičnoj otopini razorenog biljnog tkiva. Ovom reakcijom hidronijevi ioni borne kiseline postaju ponovo slobodni u otopini predloška i svojom aktivnošću spuštaju pH vrijednost do 4.6 (početna pH vrijednost borne kiseline). te nastaje sol amonij sulfat ((NH4)2SO4). uzorak ključa otprilike 4-5 min. Aparatura za određivanje sadržaja dušika. tips reagensi matična otopina prethodno razorenog biljnog tkiva. Prolazom kroz hladilo A) 30% NaOH. 0. 30% natrijav hidroksid (NaOH). G) titrator sa pH prelazi u tekući. Slika 15. U reakciji borne kiseline i amonijaka nastaje njihova kompleksna sol. Određivanje koncentracije dušika temelji se na istiskivanju dušika u obliku amonijaka (NH3) iz uzorka jakom bazom u predložak sa kiselinom poznate A B C D E G koncentracije i pH vrijednosti. Destilacijska jedinica i titrator se uključe. a pH vrijednost raste. automatska pipeta od 10 mL.6 . titrator sa pH metrom. pH vrijednost ne smije porasti preko 7 jer bi se u protivnom amonijak gubio isparavanjem. Generiranjem vodene pare. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE DUŠIKA U BILJNOM MATERIJALU Uvod u vježbu Aparat za određivanje koncentracije (slika 15) dušika sastoji se od dvije međusobno povezane jedinice: destilacijske F jedinice i titratora. B) deH2O. te kaplje u sondom predložnu čašicu u kojoj se nalazi borna kiselina.3. u plinovitom stanju.). te otvori voda za hlađenje. Materijal pribor destilacijska jedinica. F) hladilo. C) 2% H3BO3. Sulfatna kiselina je jaka kiselina koja istiskuje borne anione iz kompleksne soli amonijaka i borata. Sonda titratora za mjerenje pH uroni se u spremnik sa 30 .2. Natrijev hidroksid istikuje dušik iz uzorka u obliku amonijaka (NH3). D) kiveta sa plinoviti oblik amonijaka uzorkom.

Nakon završetka titracije potrebno je zabilježiti volumen utrošene 0. U kivetu za uzorak odpipetira se 10 mL matične otopine. Rezultati 31 . sada se na zaslonu titratora mogu pratiti promjene pH vrijednosti. te se ona pažljivo postavi u nosač na aparaturi za destilaciju.2%-tnom bornom kiselinom i izmjeri se pH vrijednost. Ako pH vrijednost odstupa od 4. Na destilacijskoj jedinici pritisne se tipka start a na upravljaču jedinice za titraciju tipka MEAS/HOLD/8.25 M H2SO4 za titraciju otopine iz predloška do pH 4.6 potrebno ju je podići ili spustiti dodavanjem 1M NaOH ili 1M HCl automatskom pipetom u spremnik s bornom kiselinom.7 (za pšenicu) ili s 6.odvaga suhe tvari uzorka u 100 mL matične otopine 7 .25 M H2SO4 veže 7 mg N) Postotak dušika pomnožen s 5.6 v [mL] . Postotak dušika u uzorku računa se po formuli: 7 * V * (100 )*10−2 v %N = m V [mL] .25 M H2SO4 .faktor za preračunavanje količine vezanog N na 0. Nakon toga pH sonda se uranja u predložnu čašicu.25M H2SO4 (1mL 0.volumen utrošene 0.alikvot matične otopine (10 mL) m [g] .25 (u prosjeku) daje približnu koncentraciju sirovih proteina.

Prema odredbama FAO i WHO od 2002. Špinat posijan zimi a ubran ljeti (naročito u vrijeme sušnog perioda) sadrži više nitrata od špinata posijanog ljeti koji se ubire tijekom jeseni i zime. Kontrola sadržaja nitrata u biljnim proizvodima sustavno se provodi u razvijenim zemljama svijeta.07 mg/kg/danu. ukiseljeno i fermentirano povrće. U dnevni unos treba računati nitrate u hrani i u vodi. U području umjerene klime gdje se povrće uzgaja u uvjetima niskog intenziteta svjetlosti razina nitrata u biljci može biti povećana jer je proces redukcije nitrata u nitrite u biljci povezan s procesom fotosinteze. Drugi problem prekomjerne razine nitrita u organizmu je što u reakciji s sekundarnim i tercijarnim aminima u kiselom mediju želuca nastaju kancerogeni nitrozamini. kelja i celera se smatra pravim „akumulatorima dušika“. Intenzitet boje razmjeran je početnoj koncentraciji nitrata.7 mg/kg/danu što je ekvivalent 222 mg/danu za čovjeka teškog 60 kg a nitrita do 0. Testne trakice imaju dvije reakcijske zone koje sadrže reagense za redukciju nitrata do nitrita i reakciju nitrita s Griess-ovim reagensom. Prekomjerna razina nitrita u organizmu može izazvati methemoglobinemiju. a to može rezultirati višim sadržajem nitrata u povrću i voću od dozvoljenog. godine potvrđen je dozvoljeni dnevni unos nitrata u organizam odraslog čovjeka te iznosi do 3. Akumulacija nitrata u biljci je posljedica prekomjernog usvajanja nitrata iz tla ili neadekvatne redukcije u biljci (redukcija do amonijaka i sinteza aminokiselina). Najjednostavnija analitička metoda za utvrđivanje sadržaja nitrata u biljnom materijalu je određivanje pomoću Reflectoquant® nitratnog testa i testnih trakica za nitrate. koju instrument određuje kolorimetrijski. Reflectoquant® nitratni test i testne trake poljoprivrednih proizvoda u EU. loše uskladišteno ili uskladišteno na duže vrijeme. Prehranom čovjek unese više nitrata nego nitrita ali se djelovanjem bakterija u probavnom sustavu nitrati reduciraju u nitrite. Sadržaj nitrata u pitkoj vodi od strane WHO ograničen je na 50 mg/L. iznimka su oštećeno povrće. kao i prilikom uzgoja povrća u staklenicima. te postoje utvrđene smjernice za nadzor kvaliteta Slika 16. 32 . ODREĐIVANJE SADRŽAJA NITRATA U SVJEŽEM POVRĆU Uvod u vježbu Sadržaj nitrata (NO3-) i nitrita (NO2-) u poljoprivrednim proizvodima je značajan pokazatelj kvaliteta proizvoda. U reakciji nitrata s reagensima testne trakice nitrati se reduciraju u nitrite a oni reagiraju s Griess-ovim reagensom gdje kao produkt nastaje azospoj crvenkaste boje određenog intenziteta. Povrće poput salate.4. Nitriti su štetniji za zdravlja čovjeka od nitrata. a u manjim količinama mogu se pronaći u suhomesnatim proizvodima. koji može posredno utjecati na zdravlje ljudi.2. bez termičke obrade. koje se često konzumira svježe. Glavni izvor unosa nitrata u organizam predstavljaju pitka voda i namirnice biljnog porijekla. špinata. bolest u kojem hemoglobin prelazi u methemoglobin koji ne može vezati kisik i time ga prenositi u tkiva te time može rezultirati smrću. Naročito je primijećena intenzivna akumulacija nitrata u lisnatom povrću. Nitiriti se putem povrća i voća unose u manjim količinama. slika 16. Na obiteljskim gospodarstvima često se prekomjerno gnoji mineralnim ili organskim gnojivima koja u svom sastavu sadrže dušik.

vaga. 33 . vodena kupelj. Nakon isteka 55 sekundi. grijače tijelo .5 kg povrća. filter-papir.Cilj Odrediti koncentraciju nitrata u otopini nitrata pomoću instrumenta Reflectoquant. Kada je instrument kalibriran treba pritisnuti tipku START i istovremeno uroniti testnu traku u filtrat u laboratorijskoj čaši. Materijal pribor i oprema: odmjerna tikvica. lonac. Ohlađeni uzorak se filtrira kroz naborani filter-papir u odmjernu tikvicu odgovarajućeg volumena i dopuni deioniziranom vodom. stakleni lijevak. Tikvica s biljnim materijalom se petnaest minuta zagrijava u kipućoj vodenoj kupelji. Na otvor tikvice treba staviti mali stakleni lijevak ili zračno hladilo kako bi se pare kondenzirale i slijevale nazad u tikvicu. tučak i tarionik biljni materijal: krumpir ili neki drugi biljni materijal naveden u tablici reagensi: otopina nitrata.električni rešo. testne trakice za mjerenje nitrata. Nakon 2 sekunde testna traka se izvadi iz filtrata a višak tekućine se odstrani povlačeći traku preko ruba čaše. U skladu s tablicom 3 se odvaže određena količina homogeniziranog biljnog materijala te se kvantitativno prenese u Erlenmeyerovu tikvicu od 250 mL uz dodatak destilirane vode ili deionizirane vode prema zapisu u tablici 1. kako bi dobili vrijednosti nitrata u mg/kg biljne mase. Dio filtrata se presipa u čistu i suhu laboratorijsku čašu. deionizirana voda Način izvođenja vježbe Potrebno je homogenizirati oko 0. od trenutka pritiska tipke START. Zvučni signal se čuje 5 sekundi nakon kojih aparat mjeri koncentraciju nitrata. Na digitalnom zaslonu automatski se pojavljuje vrijednost koncentracije nitrata u mg/L filtrata. Erlenmeyerova tikvica od 250 mL. Tablica 3. Odnosi volumena vode i biljnog materijala pri pripravi otopine za mjerenje nitrata instrumentom Reflectoquant Vrsta povrća brokula salata endivija salata glavatica krastavac mrkva paprika radič rajčica kupus krumpir Odvaga [g] 10 10 5 10 10 25 10 25 10 10 Dodatak vode [mL] 50 50 50 50 40 20 50 40 40 40 Konačni volumen [mL] 100 100 100 100 50 25 100 50 50 50 Faktor 10 10 20 10 5 1 5 2 5 5 Prije mjerenja koncentracije nitrata potrebno je kalibrirati instrument Reflectoquant. laboratorijska čaša od 100 mL. Reflectoquant instrument. instrument daje zvučni signal tada je potrebno uložiti traku na odgovarajuće mjesto u aparat. Dobivenu vrijednost potrebno je pomnožiti s faktorom preračunavanja iz tablice 3.

Rezultati Sadržaj nitrata u ______________________________ je ________________________. 34 .

sulfanilna kiselina. termostat. Visoka aktivnost ovog enzima javlja se u mladom lišću i može poslužiti za prognozu prinosa i utvrđivanju potrebe za prihranom dušikom.2. Dobivena vrijednost koncentracije nitrita u µg NO2/mL otopine množi se s koeficijentom 15 zbog preračunavanja na ukupni volumen otopine u epruveti s uzorkom lista i preračuna na 24 h. koju katalizira nitrat reduktaza u korijenu ili nadzemnim dijelovima biljke i to u citoplazmi. Redukcija nitrata odvija se u više stupnjeva od kojih je prvi redukcija do nitrita NO2. Zatim slijedi daljnja redukcija u kloroplastima (nitrit reduktaza). mora se reducirati do amonijačnog oblika. pipete. najčešće aminacijom organskih kiselina pri čemu nastaju aminokiseline i slijedi sinteza proteina. n-propanol u omjeru 3:0. Biljke dušik usvajaju tijekom cijele vegetacije . Cilj Određivanje aktivnosti enzima nitrat reduktaze u svježem uzorku lišća. kao NO3. ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI NITRAT REDUKTAZE Uvod u vježbu Nitrat reduktaza je enzim koji katalizira redukciju nitratnog oblika dušika.5. Nakon inkubacije epruveta s uzorkom se izvadi iz termostata. odmjerne tikvice od 25 mL.2). Proces nitratne redukcije zahtijeva visok utrošak energije jer se oksidacijski broj dušika mijenja od +5 do –3. doda se 3 mL otopine sulfanilne kiseline za blokiranje djelovanja enzima i 2 mL α-naftilen amida koji s nastalim nitritima stvara kompleks ružičaste boje. spektrofotometar biljni materijal: svježi uzorak lišća reagensi: inkubacijski medij (otopine kalij dihidrogenfosfat i nitrat. Materijal pribor i oprema: epruvete. Usvojeni amonijačni oblik se ne može nakupljati u biljci jer djeluje toksično te se direktno ugrađuje u organsku tvar. Nitratni oblik nije toksičan za stanicu te se može nakupljati u vakuoli. Ovi anorganski (mineralni) oblici dušika se razlikuju po svom fiziološkom djelovanju.. α-naftilen amid. ali da bi se mogao iskoristiti za sintezu dušičnih organskih spojeva. ovisno o trajanju inkubacije. Pomoću njihove koncentracije i očitanja na skali spektrofotometra konstruira se kalibracijski dijagram na kojem se očitava nepoznata koncentracija nitrita u uzorku. 35 . natrij nitrat Način izvođenja vježbe 10 cm2 lisne površine ili 1 g svježe mase lista se potopi u epruvetu s 10 mL inkubacijskog medija i stavi na inkubaciju u termostat na 36oC oko 30-60 min.8:1.i NH4+ iz tla. Intenzitet boje ovisi o koncentraciji nitrita u otopini pa se ona utvrđuje spektrofotometrijski na 536 nm uz seriju standardnih otopina poznate koncentracije.

koeficijent za preračunavanje na 24 sata (ako je inkubacija trajala 1 sat) Rezultati U svježem uzorku aktivnost nitrat reduktaze je __________________________________ ________________________________________________________________________ 36 .koeficijent za preračunavanje na razrjeđenje od 15 mL (ukupni volumen otopine u epruveti) 24 .koncentracija NO2 15 . X[µg NO2/g/24 h]= c(NO2)*15*24 µ X[µg NO2/g/24 h] .Konačna aktivnost enzima izražava se kao koncentracija nastalog NO2 po gramu svježe tvari u 24 sata.aktivnost nitrat reduktaze c(NO2) [µg NO2/mL] .

Osim navedenih karakteristika dobro je znati koliki je vremenski period života cvijeta od trenutka njegova ubiranja do trenutka njegova venuća. Cilj Utvrditi utjecaj vanjskih čimbenika na duljinu života rezanog cvijeća te odrediti vremenski period otvaranja pupova od trenutka njihova ubiranja do njihova venuća. Fiziološki procesi unutar cvijeta utječu na njegovu dugovječnost. tulipani. veličine i mirisa određene vrste cvijeća određuju vizualni i mirisni dojam cvijeta. gerberi. oblika. komora za klijanje biljaka biljni materijal: rezani vrhovi cvjetovi ruže određene sorte Prilikom odabira cvjetova potrebno je odabrati jednako razvijene pupoljke koje nakon rezanja treba uroniti u vodu i što prije transportirati u laboratorij.1. FIZIOLOGIJA RASTA I RAZVOJA 3.3. Temperatura i dobra opskrbljenost vodom su vanjski čimbenici koje možemo kontrolirati a koji utječu na fiziološke procese cvijeta. pomična mjerka ili ravnalo. flomaster. božuri. Postavljeni pokus . ljepljiva traka i škare za papir. hibiskusi. laboratorijska čaša od 250 mL. Vremenski period života cvijeta može se produžiti pravilnim rukovanjem i smanjivanjem mogućih stresnih uvjeta nakon branja. dalije itd. ŽIVOT REZANOG CVIJEĆA U VAZI Uvod u vježbu Rezano cvijeće ima određene karakteristike koje su važne uzgajivačima i trgovcima. Povišenjem temperature utječemo na intenzitet transpiracije i brzinu otvaranja pupova ali smanjujemo život rezanog cvijeća u vazi. tijekom transporta i prilikom skladištenja. Mjehurići zraka bi onemogućili apsorpciju 37 Slika 17. Obilježiti cvjetove trakom za izoliranje ili samoljepljivim papirićima te flomasterom napisati oznake od 1 do 15 K (kontrolirani uvjeti) i od 1 do 15 N (nekontrolirani uvjeti). papirnati ručnici. reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Staklenke napuniti s 500 mL vodovodne vode. karanfili. Kako bi se spriječio ulazak mjehurića zraka u ksilem škarama za obrezivanje treba odrezati oko 1 cm od reza na stabljici. plastična posuda napunjena vodom iz slavine. staklenke s probušenim poklopcem na pet mjesta. traka za izoliranje ili samoljepljivi papirići. Materijal pribor i oprema: škare za obrezivanje. Kroz poklopac svake staklenke provući 5 stabljika tako da prilikom stavljanja u staklenku dodiruju dno a lišće ispod poklopca potrebno je ukloniti. Karakteristike poput boje. menzura od 500 mL. Za ovu vježbu dobro je koristiti cvijeće koje ima krupan i zrakasto simetričan cvijet koji ne raste u cvatovima (ruže.).

volumen H2O nakon određenog vremena Usporedbom rezultata može se donijeti zaključak o intenzitetu transpiracije pri kontroliranim i nekontroliranim uvjetima. Tijekom tjedan dana biljke su nastavile proces transpiracije te se volumen vode iz staklenke smanjio.ukupni volumen H2O V1[mL] . Pukotine između poklopca i stabljike kroz koje bi mogla isparavati voda te mjesto navoja staklenke i poklopca dobro oblijepiti ljepljivom trakom (slika 17). Potrebno je donijeti zaključak usporedbom rezultata dobivenih prilikom samog postavljanja vježbe i rezultata dobivenih nakon određenog vremenskog perioda.i daljnji transport vode u biljci što bi uzrokovalo venuće biljnog materijala. bez svjetla). Tri ponavljanja obilježena oznakama od 1 do 15 N ostaviti tijekom tjedan dana pri sobnim nekontroliranim uvjetima gdje temperatura oscilira a jačina i trajanje osvjetljenja variraju. Tri ponavljanja (repeticije) odnosno tri staklenke u kojima se nalaze cvjetovi obilježeni od 1 do 15 K staviti u komoru za klijanje biljaka u vremenskom periodu od tjedan dana pri kontroliranim uvjetima Slika18. Pomičnom mjerkom ili ravnalom izmjeriti najveći i najmanji promjer pupoljka cvijeta a rezultate zabilježiti kao srednju vrijednost minimalnog i maksimalnog promjera pupoljka (slika 18). Ako se pokus ostavi duže od tjedan dana potrebno je promatrati promjene na cvjetovima do početka smanjivanja promjera cvjetova zbog venuća ocvijeća ili do vremena venuća cvjetne stapke prilikom kojeg se ona savije (slika19.). nakon nekoliko dana izloženi nekontroliranim uvjetima Intenzitet transpiracije = VU – V1 VU [mL] . Kako bi se odredio intenzitet transpiracije potrebno je izmjeriti volumen vode koji je preostao u staklenci nakon određenog vremenskog perioda te izračunati koliki volumen vode je utrošilo 5 cvjetova Slika 19. Gerberi u vazi procesom transpiracije. Biljni materijal sa poklopcem premjestiti u staklenku s odmjerenim volumenom vode i staklenku dobro zatvoriti. Prema potrebi treba dodati vodu u staklenke a količinu dodanog volumena zabilježiti i zbrojiti s prethodnim ukupnim volumenom. Nakon tjedan dana izmjeriti i izračunati srednju vrijednost promjera svih cvjetova koji su sada značajnije većeg promjera. 38 . Mjerenje promjera (na temperaturu od cvijeta 15°C. Stabljike odrezati ispod površine vode u posudi napunjenom vodom iz slavine.

K 10. K 15. N 13. K 3. K 9. N 7. N 11. K 12. N 3. N 5. K 7. K 2. N 14.Rezultati Ø1 [cm] 1. N 2. N Promjer cvijeta Ø2 [cm] Ø2 – Ø1 [cm] V1 [mL] Volumen vode V2 [mL] VT [mL] Ø1 [cm] 1. N 10. N 4. K 14. K Promjer cvijeta Ø2 [cm] Ø2 – Ø1 [cm] V1 [mL] Volumen vode V2 [mL] VT [mL] Ø1 Ø2 V1 V2 VT [cm] – početni promjer pupa (cm) [cm] – promjer cvijeta nakon određenog vremenskog perioda (cm) [mL] – početni volumen vode u staklenci (mL) [mL] – izmjereni volumen vode nakon određenog vremenskog perioda (mL) [mL] – volumen vode utrošen u procesom transpiracije (mL) 39 . N 9. N 8. N 6. K 6. N 12. K 4. K 13. K 11. K 5. N 15. K 8.

MJERENJE POVRŠINE LISTA Uvod u vježbu Dovoljna količina vode u biljci osigurava normalne fiziološke procese a time i njen kvalitetan rast i razvoj. Svi listovi se poslože na izvagani papir za koji nam je poznata površina. Biljka vodu iz zemLje preuzima korijenom pomoću procesa transpiracije i korijenovog tlaka koji provode vodu kroz ksilem prema nadzemnim organima biljke. Materijal pribor i oprema: vaga. škare. 40 . O ukupnoj površini biomase lišća ovisi i proces fotosinteze. nekoliko papira A4 formata. Svaki list se obcrta prema rubovima što vjerodostojnije. sastavljeni i razdijeljeni. Površine likova listova s jednog i drugog papira se zbroje.3. P L [cm2] = P P * m L / m P P L – površina lista P P – površina papira m L – masa lista m P – masa papira Izrezani likovi s drugog papira se izvažu i izračuna se njihova površina. Ako svi listovi jedne biljke nisu stali na jedan papir ostatak listova stavi se na novi papir poznate mase i površine. Važno je obratiti pažnju na anatomske karakteristike lista jer listovi mogu biti jednostavni. Lišće biljke su najznačajniji transpiracijski organi o čijoj površini ovisi i količina transpirirane vode. Transpiracijom biljka izlučuje vodu u obliku vodene pare sa površine nadzemnih organa te time čini najveću pokretačku silu protoka vode. Treba paziti da se ne pomiješaju likovi koji su bili nacrtani na jednom papiru s likovima koji su bili nacrtani na drugom papiru. olovka biljni materijal: listovi ruže ili gerbera (može i neki drugi biljni materijal) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Papir A4 formata potrebno je izvagati. Cilj Utvrditi površinu lisne biomase biljnog materijala. Likovi lišća s prvog papira se izvažu te se izračuna njihova površina.2. Izrežu se likovi lišća s papira. P [cm2] = a * b Sa jedne biljke se odvoje svi listovi pazeći da ostanu cjeloviti. izmjeriti njegovu dužinu i širinu te izračunati njegovu površinu. metar.

K 10. N 2. K 6. K 3. N 15. N 10. K 7. N 14. K 5. N 11. K 13. K 14. N 4. K N – biljke postavljene u nekontroliranim uvjetima K – biljke postavljene u kontroliranim uvjetima Problemski zadaci 1. N 13. N 1. N 5. N 12. Izračunaj koliko će vode biljka transpirirati preko površine lista od 1 dm2? 41 . K 12.Rezultati Ovu tablicu treba upotpuniti rezultatima dobivenim iz biljnog materijala korištenog u vježbi „Život rezanog cvijeća u vazi“. N 6. N 7. K 15. Ukupno Srednja Srednja Površina Površina lista Ukupno [cm2] vrijednost [cm2] vrijednost lista [cm2] [cm2] [cm2] [cm2] 1. K 8. N 3. K 4. K 11. K 2. N 9. K 9. N 8. U sedam dana biljka koja ima lisnu površinu od 5 dm2 transpiracijom izgubi 250 mL vode.

Gibanje listova ocvjećja moguće je uočiti i prilikom promjena u intenzitetu osvjetljenja. fotonastijska gibanja listova kiselice (Oxalis acetosella) (slike preuzete: http://bitkiselumit.5°C. cvjetovi tulipana reagiraju na razliku u temperaturi od 1 . seizmonastije kod kojih su gibanja uzrokovana mehaničkim podražajima. Većina biljnih vrsta otvara cvjetove ili listove prilikom jačeg intenziteta svjetlosti a zatvara prilikom slabijeg.2 .com/eksi-yoncanin-faydalari_30376161. Termonastije su uočljive kod cvjetova mnogih biljaka koji se otvaraju tijekom dana kada je temperatura zraka povišena a zatvaraju se kada je temperatura zraka snižena. Poznate su još i kemonastije kod kojih su gibanja uvjetovana kemijskim podražajem. Šafrani i tulipani listove ocvjećja mogu otvarati i zatvarati i nekoliko puta tijekom dana ovisno o temperaturnim prilikama a promjene se kod njih očituju već nakon nekoliko minuta. Neke biljne vrste se očituju i obrnutim gibanjem svojih organa u odnosu na intenzitet svjetlosti.3. Nastijska gibanja rjeđe su rezultat nejednolikog rasta suprotnih strana organa a češće promjenama turgora koje su reverzibilne. tigmonastije kod kojih su gibanja uvjetovana trenjem biljke o čvrstu podlogu itd.3°C a cvjetovi šafrana reagiraju na razliku u temperaturi već od 0. Ako su nastije uvjetovane promjenama temperature zovemo ih termonastije. ako su uvjetovane promjenama intenziteta svjetlosti zovemo ih fotonastije (slika 20).0. Različite biljne vrste različito su osjetljive na promjene temperature npr.html ) 42 . Slika 20.3. NASTIJSKA GIBANJA Uvod u vježbu Nastijska gibanja ili nastije su gibanja biljnih organa određena njihovom građom a pokrenuta podražajem iz okoline koji biljci služi samo kao signal.blogcu.

Brzina otvaranja cvijeta odnosno cvata ovisi o biljnom materijalu.A TERMONASTIJE Cilj Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na temperaturu kao vanjski faktor utjecaja. Rezultati i zaključak 43 . Kako bi promatrali termonastije nekoliko biljaka treba staviti u prostoriju u kojoj je temperatura zraka oko 20°C. Biljke iz prostora s temperaturom zraka 20°C prenijeti u prostor s temperatura zraka 5°C a biljke koje su bile na 5°C prenijeti u prostor s temperaturom zraka 20°C. komora za klijanje cvijeća. pomična mjerka. Nakon nekog vremena biljke će reagirati a pomaci u gibanju organa će se lako uočiti vizualnim pregledom.3. hladnjak biljni materijal: cvjetovi tulipana (Tulipa sp. U nemogućnosti postavljanja pokusa u prostorije s odgovarajućom razlikom u temperaturi biljke se mogu staviti i u komoru za klijanje biljaka na 20 -tak°C i u hladnjak na 5°C.) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s vodom. Rezultate i zaključak zapisati. Kada se biljke prilagode uvjetima treba ih zamijeniti na slijedeći način. Materijal pribor i oprema: vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom.3. na način opisan u vježbi vase life. Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta.). cvjetovi šafrana (Crocus sp. prije i nakon nastalih promjena. a nekoliko biljaka iste vrste treba staviti u prostoriju u kojoj je temperatura zraka oko 5°C.

). listovi kiselice (Oxalis acotesella) reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Biljni materijal korišten za ove vježbe može biti u loncima za cvijeće sa zemljom ili u vazi s vodom. veća kartonska kutija ili komora za klijanje biljaka. cvatovi maslačka (Taraxacum officinale).). Rezultati i zaključak: 44 . Materijal pribor i oprema: vaza ili lonac za cvijeće sa zemljom. Kako bi promatrali fotonastije jednu biljku izložimo direktnom svjetlu a drugu iste vrste zamračimo ili je stavimo u komoru za klijanje biljaka pri čemu treba paziti kako bi obje biljke bile izložene jednakoj temperaturi i vlažnosti zraka. cvatovi tratinčice (Bellis perenis). Pomičnom mjerkom se može izmjeriti promjer cvijeta. cvatovi nevena (Calendula sp. Nakon 1 do 2 sata biljke će reagirati na promjenu intenziteta svjetlosti.B FOTONASTIJE Cilj Uočiti i dokazati gibanje organa biljnog materijala u odnosu na svijetlost kao vanjski faktor utjecaja. prije i nakon nastalih promjena. Rezultate i zaključak zapisati. pomična mjerka biljni materijal: cvjetovi tulipana (Tulipa sp.3.3. na način opisan u vježbi vase life.

Problemski zadaci: 1. Grašak je biljka za koju je karakteristično penjanje uz čvrstu podlogu pomoću vitica. Poznato je kako stidljiva mimoza (Mimosa pudica) prilikom mehaničkih podražaja listova (npr. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje? 45 . dodir rukom) skuplja svoje liske. Skupljanje liski se odvija vrlo brzo no faza potpunog oporavka traje 30-tak minuta. Razmisli i zaključi kako se zove takvo nastijsko gibanje? 2.

a razlika u odnosu na standardni test klijavosti je u vremenu naklijavanja koje je kraće.20 5 4 4 4 4 4 8 10 7 10 8 7 80 85 85 80 85 90 Biljna vrsta Glycine max (L. Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih kultura Period Temperatura Period za za Masa Veličina Masa °C ocjenu Minimalna ocjenu partije prosječnog radnog (stalna ili standardne klijavost energije sjemena uzorka uzorka izmjenjiva) klijavosti (%) (kg) (g) klijanja (g) (dani) (dani) 1000 1000 1000 50 1000 1000 500 200 120 5 120 900 20-30. Ispitivanje se obavlja na radnom uzorku jedne partije sjemena u laboratorijskim uvjetima. a podudarnost ovih parametara s poljskim nicanjem je neupitna. 25. tablica 4. 10000 25000 40000 46 .3. Triticum aestivum Zea mays L. odnosi na njezine osnovne dijelove (korijenov sustav. Neizostavni su parametri za određivanje norme sjetve u cilju postizanja željenog sklopa biljaka u polju te su kao takvi naišli na široku primjenu u praksi. Uvjeti za ispitivanje standardne klijavosti i energije klijanja pojedinih ratarskih kultura značajno se razlikuju. uglavnom preko ostvarenog sklopa biljaka u polju. U okviru ovoga testa utvrđuje se i energija klijanja kao informativni podatak. ali i značajnim utjecajem na rani porast biljaka (više je vezan uz energiju klijanja).4. Najveća vrijednost ovih testova upravo je u preciznom predviđanju nicanja biljaka u polju. 20000 Hordeum vulgare L. kotiledone i koleoptilu). izdanak. a zatim standardna klijavost. Tablica 4. Ovi parametri usko su vezani i s potencijalnim prinosom. Oba pokazatelja predstavljaju broj normalnih klijanaca građenih na način da nije ugrožen rast i razvoj mlade biljke što se.25 20-30. ovisno o biljnoj vrsti.25.) 25000 Merr. Helianthus annuus L.A STANDARDNA KLIJAVOST I ENERGIJA KLIJANJA SJEMENA Uvod u vježbu Standardna klijavost i energija klijanja prihvaćeni su kao glavni pokazatelji fiziološke kvalitete sjemena. Standardna klijavost predstavlja broj normalnih klijanaca prema ukupnom broju sjemenki stavljenih na naklijavanje. pa se u okviru istoga testa prvo utvrđuje energija klijanja. 25000 Medicago sativa L. KLIJAVOST I VIGOR SJEMENA 3.4.20 20 20 20 20-30.

komora za klijanje biljaka biljni materijal: sjeme graha dvije sorte (pri izboru sorte graha dobro je izabrati jednu sortu niskog rasta a drugu visokog rasta) reagensi: destilirana voda Način izvođenja vježbe Prije vježbe potrebno je izbrojati i izvagati 100 sjemenki graha od svake sorte. Smotuljke je potrebno obilježiti kako bi znali koja sorta Slika 21. elastični metar. svi metodom na filter-papiru smotuljci se zajedno s kalupom stave u neprozirnu vreću za smeće kako bi gubitak vode bio sveden na minimalnu količinu. laboratorijska čaša. Elastičnim metrom izmjeri se koliko su dugačke klice svake proklijale sjemenke i izračuna srednju vrijednost klijanaca za svaku sortu. flomaster. Prilikom postavljanja smotuljaka u kalup neka smotuljci budu orijentirani otvorom prema gore kako bi sjemenke prilikom rasta mogle proklijati izvan filter-papira. filter-papir. Nekoliko sati prije vježbi sjeme je potrebno potopiti u vodu kako bi se potaklo njegovo klijanje. Nakon što je sjeme absorbiralo dovoljnu količinu vode višak je potrebno isipati a sjemenke složiti na arak filter-papira. 47 . Sjemenke neka budu jednako okrenute kako bi klice neometano mogle klijati jedna pokraj druge. Kako bi osigurali dovoljnu količinu vlage potrebne za klijanje sjemena pomoću boce špricalice filter-papir se natopi vodom. Nakon tjedan dana napravi se analiza rasta. gumica za zimnicu. Ovisno o sorti koju smo izabrali sjemenke mogu biti različite veličine te u skladu s tim na arak treba složiti 20 do 50 sjemenki graha. Arak filter-papira treba postaviti horizontalno te ga podijeliti na tri jednaka dijela po dužoj stranici. Sjemenke graha se slože u jednom redu na sredinu dva sloja filter-papira (slika 21). Smotuljak okomito treba postaviti u kalup za nasađivanje cvijeća (slika 21). Izračuna se prosječna masa klijanaca. Tako složen filter-papir se čvrsto zarola od jednog kraja prema drugom poput štrudle a smotuljak dodatno učvrsti gumicom za zimnicu. Nakon toga se preostala jedna trećina filter-papira presavije preko sjemenki graha. vaga. boca špricalica. Ako nije pristupačna klima ispitivanje klijavosti standardnom komora sa mogućom regulacijom vlage (fitotron). Jedna trećina filter-papira se presavije po dužini. Prebroji se koliko sjemenki graha je proklijalo a koliko nije te se izračuna postotak klijavosti za svaku sortu graha. plastična čaša. Pri tome je potrebno pripaziti kako se ne bi nasipalo suviše vode. crna vreća za smeće. Sjeme graha se stavlja u komoru za klijanje biljaka na 20°C u periodu od tjedan dana. Materijal pribor i oprema: kalupi za cvjetne nasade. Postavljanje testa za graha je u kojem smotuljku.Cilj Odrediti klijavost sjemena dvije različite sorte graha. Noktom se pažljivo odvoje kotiledoni od hipokotila te se hipokotili izvažu za svaku sortu graha posebno.

Prilikom prvog. Energija klijanja i klijavost utvrđuju se brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda predviđenog za naklijavanje (slika 22). a nedovoljno razvijeni i deformirani klijanci. d hip [mm] m [g] 48 . a i ostalih ocijenjivanja izdvajaju se normalni klijanci. deformirani (na jednoj ili više osnovnih struktura prisutan je deformitet) ili istruli. Slika 22. 2. U postotak klijavosti također se ne uračunava niti mrtvo sjeme koje ne pokazuje znakove razvoja klice. a suma postotaka normalnih i deformiranih klijanaca te neklijavog sjemena mora biti 100. Pri tome partija sjemena koja je namijenjena za distribuciju mora zadovoljiti propisanu minimalnu klijavost (tablica 4). d hip [mm] 1. Utvrđivanje klijavosti sjemena graha (lijevo) i soje (desno) standardnom metodom na filter-papiru Rezultati 1 sorta graha % NEP. Takvi klijanci su oštećeni (nedostaje ili je oštećena neka od osnovnih struktura).Usporedbom dobivenih rezultata može se zaključiti koja sorta graha ima bolje kvalitete sjemena. prazno sjeme te sjeme oštećeno napadom kukaca. Rezultat se izražava u %. ostavljaju se do kraja ispitivanja klijavosti. 3. – postotak neproklijalih sjemenki graha d hip [mm] – srednja vrijednost dužine klica sjemenki graha izražena u milimetrima m [g] – srednja vrijednost mase klijanaca graha izražena u gramima m [g] 2 sorta graha % NEP. Ukupno % NEP. kao i neklijavo sjeme. klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak klijavosti. Za razliku od normalnih klijanaca.

Izračunaj koliko grama sjemena treba posaditi na 10 m2 ako želimo da nam proklija 200 biljaka? Pri računanju uvrsti podatke dobivene iz postavljenog pokusa. 49 .Problemski zadaci 1.

3.4.B COLD TEST Uvod u vježbu Za podrobniju ocjenu kvalitete sjemena uz test standardne klijavosti i energije klijanja preporučuje se provesti i druge testove vigora sjemena od kojih posebnu važnost ima cold test. Ovaj test ima osobiti značaj kod analize partija sjemena s graničnim vrijednostima standardne klijavosti i energije klijanja, dulje skladištenih partija sjemena, osobito ako je skladištenje bilo neuvjetno, te partija sjemena loših fizikalnih pokazatelja i narušenog zdravstvenog stanja. Nadalje, cold test ima veliku važnost ukoliko se prakticiraju rani rokovi sjetve kada postoji velika opasnost od redukcije sklopa biljaka (hladno tlo saturirano vlagom, prisutnost patogena, produljen period od sjetve do nicanja) jer će tada, u odnosu na ostale testove vigora sjemena, cold test dati najbolju procjenu poljskog nicanja. Generalno se može reći da partije sjemena s većim vrijednostima cold testa u pravilu ostvaruju bolje poljsko nicanje, osobito u lošijim uvjetima u polju. Cilj Odrediti postotak klijavosti sjemena ratarskog usjeva, po dale opisanoj metodi cold testa Materijal pribor i oprema: rolani filter-papir, plastične vrećice, klima komora, tlo i pijesak u omjeru 1:1 biljni materijal: sjeme kukuruza ili soje reagensi: vodovodna voda Način izvođenja vježbe Pripremi se podloga za sjetvu uzimanjem prosječnog uzorka tla s table na kojoj je prethodne godine uzgajana testirana kultura. Uzorak tla se osuši, usitni i prosije, kako bi se postigla fina mrvičasta struktura. Tako pripremljen uzorak tla pomiješa se s pijeskom u omjeru 1:1. Postupak naklijavanja je sljedeći: prethodno navlaženi filter-papir stavi se na hlađenje (10°C) 24 h prije sjetve, kao i pripremljena smjesa pijeska i tla. Na navlaženi i ohlađeni filter-papir rasporedi se sjeme koje se zatim pospe sa 100 g smjese pijeska i tla. Radni uzorak čini 4x50 sjemenki, sjemenke se iz uzorka uzimaju nasumce i raspoređuju na podlogu za klijanje. Filter-papir Slika 23. Cold test sjemena soje po modificiranoj se zatim preklopi i dodatno «Rolled towel» metodi navlaži s onoliko vode koliko mogu upiti papir i podloga. 50

Posijani uzorak zamota se u tuljak, stavi u plastičnu vrećicu i vertikalno odloži u termostat na temperaturu 10°C, bez utjecaja svjetla. Potom slijedi naklijavanje na temperaturi 25°C u trajanju od 5 dana, također bez prisutnosti svjetla. Konačno očitavanje klijavosti slijedi nakon ukupno 12 dana (slika 23). Ovoj metodi, uz moguće modifikacije, podliježu slijedeće kulture: kukuruz, soja, grašak i suncokret. Kao i kod testa standardne klijavosti, i cold test se utvrđuje brojanjem normalnih klijanaca nakon perioda predviđenog za naklijavanje i izražava se u %. Za razliku od normalnih klijanaca, klijanci za koje se ocijeni da nemaju sposobnost razvitka u normalnu biljku ne uračunavaju se u postotak klijavosti (oštećeni, deformirani i istruli klijanci te mrtvo sjeme). Rezultati

51

3.4.C ELEKTRIČNI KONDUKTIVITET SJEMENA Uvod u vježbu Gubitak vigora sjemena uvelike je vezan uz stanje staničnih memebrana i sjemenjače, a povećanjem propusnosti navedenih struktura redovito dolazi do opadanja vigora sjemena. Upravo na ovim činjenicama utemeljena je metoda testiranja vigora sjemena putem utvrđivanja električnog konduktiviteta sjemena kojim se mjeri intenzitet ispiranja elektrolita iz biljnog tkiva tijekom namakanja sjemena u vodi. U osnovi, vrijednost električnog konduktiviteta predstavlja stupanj provodljivosti otopine u kojoj je sjeme namakano i bit će veći ukoliko tijekom namakanja otpuštanje elektrolita bude veće. Nadalje, intenzivnije otpuštanje elektrolita tijekom namakanja veće je što je propusnost sjemenjače i staničnih membrana veća pa otuda pad vigora sjemena redovito prati porast električnog konduktiviteta sjemena. Ovdje treba naglasiti i činjenicu da što je sjeme nižeg vigora, ima nižu klijavost, energiju klijanja i cold test, dok mu je električni konduktivitet u porastu, pa je korelacija konduktiviteta sjemena s ostalim laboratorijskim pokazateljima, kao i s poljskim nicanjem, redovito negativna. Cilj: Odrediti promjene električnog konduktiviteta sjemena soje u fazi imbibicije kroz određeni vremenski period. Materijal pribor i oprema: konduktometar, plastične čašice biljni materijal: sjeme bilo kojeg ratarskog usjeva reagensi: destilirana voda Način izvođenja vježbe Radni uzorak čini 4x50 sjemenki koje se prethodno izvažu, a zatim stavljaju na namakanje u Erlenmeyerove tikvice u 250 mL deionizirane vode. Voda je temperirana na 20°C, a uzorci se zatim odlažu u termostat na istu temperaturu od 20°C u trajanju od 24 h. Po isteku vremena predviđenog za namakanje sjemena obavlja se mjerenje električnog konduktiviteta. Neposredno prije mjerenja Slika 24. Utvrđivanje električnog pripremljeni uzorak lagano se miješa u konduktiviteta sjemena soje trajanju od 10-15 sekundi, a zatim se konduktometrom konduktometrom izvrši mjerenje (slika 24) i očitaju dobivene vrijednosti. Ova metoda razvila se na grašku, primjenjuje se na ostalim krupnozrnim leguminozama, ali i na kukuruzu, pšenici i nekim drugim kulturama.

52

Rezultati i zaključak Očitane vrijednosti s konduktometra (µScm-1) odnose se na ukupnu masu namakanog uzorka (50 sjemenki). Stoga se utvrđena vrijednost preračuna na masu od 1 g sjemena i izrazi u µScm1 -1 g . Dobiveni rezultati ocjenjuju se prema skali za krupnozrne leguminoze (Powell i Matthews, 1981., tablica 5).

Tablica 5. Skala za ocjenu vrijednosti električnog konduktiviteta za krupnozrne leguminoze Električni konduktivitet (µScm-1g-1 ) <25 25-29 30-43 >43 Ocjena kvalitete sjemena i preporuka za sjetvu sjeme prikladno i za ranu sjetvu sjeme može biti prikladno za ranu sjetvu, ali uz određeni rizik sjeme nije prikladno za ranu sjetvu i nepovoljne uvjete sjeme neprikladno za sjetvu

53

partije sjemena lošijeg zdravstvenog stanja neće ostvariti željene sklopove biljaka u polju.4. Ex Gaum). zdravstvenu analizu treba uvažiti kao nadopunu ostalim testovima vigora sjemena i boljem uvidu u stvarno stanje pojedine partije sjemena. radni uzorak čini 4x50 sjemenki. Kao prvo. a sve to negativno će se odraziti na prinos. Pregled sjemena na plamenjaču provodi se na netretiranom sjemenu. ali i štetnih fizioloških stanja. 54 . metodom vizualnog pregleda. Radni uzorak (50 g sjemena za strna žita) stavlja se u tikvicu i prelije sa 70 mL destilirane vode uz dodatak 2 kapi tekućeg deterdženta za pranje suđa. Posebnu važnost ima zdravstvena analiza uvezenih partija sjemena zbog mogućeg unosa novih patogena i opasnosti za domaću proizvodnju. pa se generalno može reći da se vigor sjemena proporcionalno smanjuje s povećanjem intenziteta zaraze. bakterija i virusa. Zatim treba navesti rizik koji sa sobom nosi sjetva zaraženim sjemenom . Naime. rezultati ispitivanja zdravstvenog stanja sjemena mogu ukazati na nužnost provođenja tretiranja sjemena u cilju iskorjenjivanja patogena koji se prenose sjemenom ili smanjenja opasnosti od prijenosa zaraze. Iz svake kivete mikroskopira se najmanje 4 kapi. stagnacije usjeva. razvoja bolesti u polju. kukaca i grinja. Tikvica se začepi i mućka u trajanju od 10 minuta (ručno ili na automatskoj mućkalici). Odlije se tekućina iznad taloga i dodaje destilirana voda do 2 mL. te napravi suspenzija taloga. a) Metoda pregleda naturalnog sjemena Metoda se svodi na vizualni pregled uzorka uz moguću upotrebu stereo-mikroskopa. Nadalje se. a odnosi se na utvrđivanje prisutnosti uzročnika bolesti (gljivice. parazitskih nematoda i kukaca. Stoga treba izdvojiti nekoliko aspekata koji daju veliku važnost provedbi zdravstvene analize sjemena. Nadalje. Prisutne hlamidospore izbroje se korištenjem hemacitometra. Osim toga. Većina uzročnika bolesti prenosi se sjemenom pa korištenje zdravog sjemenskog materijala ima važno mjesto i u prevenciji i smanjivanju pojavnosti bolesti. smanjenja prinosa i komercijalne vrijednosti usjeva uopće.D ZDRAVSTVENO STANJE SJEMENA Uvod u vježbu Važan činitelj vigora sjemena je i njegovo zdravstveno stanje. veća zaraženost sjemena uzročnicima bolesti utvrđenim zdravstvenom kontrolom upućuje na potrebu tretiranja sjemena. Tako se vizualnim pregledom sjemenjače utvrđuje prisutnost plamenjače na sjemenu soje (Peronospora manshurica (Naum) Syd. U konačnici. a konačan rezultat izražava se u postotku sjemena zahvačenog plamenjačom. prisutnost sklerocija. b) Metoda ispiranja sjemena Metoda ispiranja sjemena koristi se za analizu sjemena strnih žita i trava na prisutnost patogena Tilletia spp. 10 mL suspenzije dobivene mućkanjem centrifugira se 4 minute na 2400 okretaja. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja bez inkubacije Ove metode ne daju podatke o vijabilnosti patogena. bakterije i virusi i ostale). Ispitivanje zdravstvenog stanja sjemena provodi se primjenom različitih metoda.od prorjeđivanja sklopa. mogu utvrditi promjene boje i oštećenja sjemena. Brojni radovi potvrđuju negativnu korelaciju između intenziteta zaraze sjemena pojedinim patogenima i vigora. Metode zdravstvene analize sjemena mogu se podijeliti na dvije osnovne skupine ovisno o tome prethodi li im proces inkubacije: 1. bolesni klijanci oslabit će i zaostati rastom i razvojem.3. sjeme može biti zaraženo velikim brojem gljivica. cisti nematoda. a uslijed infekcije patogenima može značajno opasti vigor sjemena.

s prikladnim osvjetljenjem (odozdo). prisutnost štetnika i štetnih fizioloških stanja na ili u sjemenu te na klijancima. Ekstrakcija i čišćenje embrija obavlja se tako da se radni uzorak stavi u jednu litru svježe pripremljene 5%-tne vodene otopine natrijeve lužine (NaOH) i drži 24 sata na 20°C. simptome razvoja bolesti. Embriji se izdvoje pomoću sita s otvorima promjera 1 mm. pri točki ključanja.volumen tekućine u kvadratu hemacitometra. Petrijeve zdjelice prethodno su obložene Slika 25. kako bi se obavio pregled. Radni uzorak mase 200-240 grama tretiranog ili netretiranog sjemena podijeli se na dva ponavljanja. Na kraju se embriji premjeste u svježi. Može se odrediti površinska ili dubinska zaraza. da se odvoje embriji. a) Metoda na filter-papiru Radni uzorak od 400 sjemenki rasporedi se u Petrijeve zdjelice (po 10 zrna u jednoj Petrijevoj zdjelici).masa sjemena 0.volumen suspenzije (2 mL) W [g]. Pregledava se 1000 embrija iz svakog ponavljanja pod povećanjem 16 – 25 puta. Embriji se u laktofenolu drže 30 sekundi. koji izlaze kroz smekšani perikarp. c) Metoda pregleda embrija Ova metoda koristi se na sjemenu ječma za određivanje zaraze prašnom snijeti (Ustilago nuda). Zatim se embriji premjeste u mješavinu jednakog omjera glicerola i vode. 2. Traži se karakterističan zlatno-smeđi micelij gljivice Ustilago nuda. Metode ocjenjivanja zdravstvenog stanja nakon inkubacije Nakon razdoblja inkubacije radni se uzorak ispituje na prisutnost uzročnika bolesti.prosječan broj spora u kvadratu hemacitometra (ukupan zabilježeni broj/8) V [mL] .Broj spora u gramu sjemena se izračunava po formuli: X = N ∗V 0.0001 . Rezultat pregleda izražava se u % zaraženog sjemena. gdje se odvajaju od eventualnih ostataka sjemena. Dodatno čišćenje embrija obavlja se u digestoru tako da se embriji premjeste u laboratorijsku posudu u kojoj se nalazi 75 mL čistog svježe pripravljenog laktofenola. Nakon toga cijeli se uzorak premjesti u prikladni kontejner i ispere u toploj vodi.0001 ∗ W N . lagano zagrijani glicerol. Utvrđivenje zdravstvenog stanja sjemena soje po metodi na filter-papiru 55 .

koje često prekrivaju cijelo sjeme. 12 sati u tami). Tako „posijano“ sjeme odlaže se u termostat na inkubaciju. Septoria nodorum). Kod stavljanja sjemenki u Petrijeve zdjelice razmak treba biti najmanje 2 cm. Rezultat analize izražava se u % zaraženog sjemena. prilikom inkubacije sjeme se prvo stavlja u komoru za naklijavanje na 20°C kroz 24 sata. Nakon toga se Petrijeve zdjelice sa sjemenkama stavljaju na inkubaciju 7 dana na 20°C u mraku. Prije stavljanja radnog uzorka (400 sjemenki) na hranjivu podlogu obavlja se predtretman (dezinfekcija) u 1%-tnoj otopini natrijeva hipoklorita. Iz tog je razloga za pojedine metode poželjno izvršiti predtretman koji se odnosi na bilo kakav fizikalni ili kemijski tretman radnog uzorka proveden u laboratorijskim uvjetima. a primjenjuje se na sjemenu ozime pšenice i ozimog ječma. Modifikacija se odnosi na temperaturu inkubacije. Nakon 7 dana golim okom se određuje broj sjemenki s karakterističnim kolonijama. Kao hranjiva podloga obično se koristi krumpir-dekstroza agar (PDA) ili malc agar. b) Metoda izmrzavanja Metoda izmrzavanja predstavlja modificiranu metodu na filter-papiru. Rhizopus spp. sucokreta i jarog graška. Na taj način ugrožavaju sam ishod analize jer mogu „maskirati“ konačan rezultat. d) Predtretman (prethodna obrada) Pojedine gljivice (npr. gustog bijelog ili kremastog micelija. mogu prorasti zdravu biljku ili se razvijati s patogenom na zaraženom sjemenu. Rezultati Rezultati zdravstvene analize prikazuju se kao postotak zaraženih sjemenki ili kao broj organizama po težini ispitanog uzorka. uključujući i podtretman. Nakon toga Petrijevke sa sjemenom drže se u komori za naklijavanje na 20°C do kraja inkubacije (osim kod determinacije gljive Microdochium nivale gdje temperatura u komori za naklijavanje mora biti 15-18°C). na koji se sjemenke rasporede tako da je njihova međusobna udaljenost najmanje 2 cm. c) Metoda na hranjivoj podlozi Metoda na hranjivoj podlozi koristi se za utvrđivanje zaraze sjemena pšenice sa smeđom pjegavosti pljevica. uz izmjenično osvjetljenje (12 sati osvjetljenja u spektru od 320 do 420 nm. Pri tome je nužno rabiti znanstvena imena uzročnika bolesti.) brzo se šire na filter-papiru. Tako se u slučaju potrebe za površinskom dezinfekcijom sjemena može provesti predtretman natrijevim hipokloritom namakanjem sjemena u trajanju od 10 minuta u otopini natrij hipoklorita koja sadrži 1 volumni % aktivnog klora. Metoda se primjenjuje na sjemenu soje (Slika 25). spororastućeg. naznačiti metodu zdravstvene analize koja je korištena. zatim sljedećih 24 sata u zamrzivaču na -20°C.navlaženim filter-papirom. Nakon inkubacije slijedi determinacija i utvrđivanje postotka zaraze sjemena. a 14 dana za tretirano sjeme pri temperaturi od 20°C. gljivicom Leptosphaeria (Stagonospora) nodorum (syn. Hranjiva podloga izlijeva se u petrijive zdjelice promjera 9 cm. Naime. 56 . u koji se kod pripreme dodaje 100 ppm streptomicin sulfata. ako je proveden. Inkubacija za netretirano sjeme traje 10 dana.

Cilj Naučiti modele analize rasta biljaka te na primjerima utvrditi naučeno. Temperatura. količina klorofila a i sl. Kakva je relativna brzina rasta u ispitivanom razdoblju od 80 dana? R= 1 50 g × = 0.5. Zavisnost između A (asimilacijska površina) i W (suha tvar biljke) može biti linearna ili kvadratna.3. ukupni i proteinski dušik u lišću.). a nakon 180 dana 100 g. osvjetljenje i dovoljna količina vode važni su faktori koji utječu na dobivanje zdrave i snažne biljke s dobro razvijenom lisnom površinom i dobrim prirastom. RELATIVNA BRZINA RASTA (R) Relativna analiza rasta ili njenih pojedinih organa u određenom vremenskom razdoblju izražava se kao prirast u jedinici suhe tvari: R= 1 dW × W dt W dW dt = ukupna masa suhe tvari biljke = prirast mase suhe tvari = vremenski interval Primjer: Nakon 100 dana vegetacije prosječna masa suhe tvari korijena šećerne repe iznosi 50 g. Kod linearnog oblika zavisnosti jednadžba se raščlani prema Wiliamsu: 57 . ANALIZA RASTA BILJAKA Uvod u vježbu Visokoproduktivni uzgoj biljaka zahtjeva postizanje optimalnih uvjeta prilikom rasta i razvoja biljaka. Kvalitetna gnojidba također ima značajan učinak na povećanje poljoprivrednog uroda i priroda.00625g / dan 100 80dana NETO ASIMILACIJA (E) Vrijednost čistog efekta asimilacije izračunava se na slijedeći način: E= 1 dW × A dt Neto asimilacija (E) je prirast suhe tvari izražen na jedinicu veličine koja pokazuje aktivnost fotosintetičkog aparata biljke (površina lišća.

Zavisi od doba vegetacije. a masa suhe tvari 60 g. Kolika je prosječna neto asimilacija uz pretpostavku linearne zavisnosti između lisne površine i suhe tvari biljke? E= (60 − 25) × (ln 34 − ln 22) = 0. a 20 dana kasnije 8. Nakon 30 dana lisna površina bila je 34 dm2. F) Proporcionalna lisna površina je omjer lisne površine i ukupne mase suhe tvari.1 t/ha.008t / ha / dan (180 − 160) × 10 PROPORCIONALNA LISNA POVRŠINA (lisnatost. 58 .04 g / dan / dm 2 (34 − 22) × (90 − 60) PRODUKTIVNOST (C) Veličina prirasta ili produktivnost izražava se prema jednadžbi: C= dW dt × P dW = razlika između dva uzastopna mjerenja produktivnosti (primarne – prinos ili biomase kod utvrđivanja prirasta populacije) P = površina tla na koju se produktivnost odnosi Primjer: Na 10 ha utvrđen je biološki prinos šećera šećerne repe 6.E= dW × (ln A2 − ln A1 ) dA × dt Kod kvadratnog oblika zavisnost jednadžbi glasi: E = 2× dW ( A2 + A1 ) × dt Primjer: Nakon 60 dana vegetacije prosječna površina lišća jedne repe je 22 dm2 uz masu suhe tvari od 25 g.5 = 0. Kolika je produktivnost usjeva? C= 8.5 t/ha nakon 160 dana vegetacije.1 − 6. F= A W Ovaj pokazatelj je relativna mjera fotosintetičke aktivnosti lišća i značajan je za utvrđivanje razlika između pojedinih sorti i biljnih vrsta.

FP = ( A2 − A1 ) × dt( m 2 dan ) 2 59 . Primjer: Jedna biljka pšenice ima razvijenih 5 listova prosječne površine 10. LAD se može brojčano iskazati kao površina ispod krivulje lisne površine u razdoblju vegetacije.72 m2/m2 tla FOTOSINTETIČKI POTENCIJAL (FP) Veličina fotosintetičkog potencijala povezana je s otpornošću sorata prema nepovoljnim uvjetima. Koliki je LAI ako je sklop usjeva 700 biljaka/m2? 700 × 10 = 700 × 12 = 700 × 17 = 700 × 25 = 700 × 32 = Σ= 7000 8400 11900 17500 22400 67200 cm2 = 6. a za travne fitocenoze 7 do 10 i zavisi uglavnom od vertikalne strukture fitocenoze. što podrazumijeva i regeneraciju izgubljenog lišća. 12. 17. Prinos zrna pšenice stvara se uglavnom fotosintetičkom aktivnošću asimilacijskih organa u drugoj polovini vegetacije. Teorijski optimum LAI je onda kada i najniži listovi dobivaju toliko svjetla da je omjer između fotosinteze i disanja veći od 1 (iznad kompenzacijske točke). zbog čega je naročito značajna veličina FP u razdoblju poslije klasanja. 25 i 32 cm2. Optimalna vrijednost LAI ima vrlo značajnu ulogu u produktivnosti biljaka. Razlike između sorata mogu većim dijelom potjecati upravo od razlika u LAI jer je produktivnost fitocenoza (C) umnožak prosječne lisne pokrovnosti i čistog efekta asimilacije (E): C = L× E Optimalna veličina LAI za poljoprivredne vrste je između 3 i 5.LISNA POKROVNOST (LAI) Lisna pokrovnost (LAI) je omjer između lisne površine populacije i površine tla kojoj ona pripada. Integralna površina (LAD) je mjerilo sposobnosti biljaka da održe stvorenu lisnu površinu.

893 g (Pp) ŽI = 2.502 g a prinos zrna (Pp) je 2.001 g koliki je udjel uroda u prinosu biljke? Biološki prinos biljke = 4.502 60 .ŽETVENI INDEKS (ŽI) Žetveni indeks (ŽI) je postotni udjel poljoprivrednog prinosa (urod) u ukupnoj biomasi (poljoprivredni prinos ili prirod). ŽI = Pp × 100 [%] Bp Primjer: Ako je biološki prinos biljke (Bp) 4.001× 100 [%] 4.395 g (Bp) Prinos zrna biljke = 1.

Cilj Utvrditi postojanje alelopatskih odnosa u fazi klijanja sjemena između različitih biljnih vrsta. lucerna. filter-papir. Postojanje alelopatski odnosi u fazi klijanja sjemena se utvrđuje se izračunavanjem postotka isklijalih sjemenki različitih biljnih vrsta bez prisustva drugih sjemenki i u kombinacijama sa sjemenkama jedne ili dvije druge biljne vrste. pšenice. Za pokus se koristi sjeme tri različite biljne vrste. folija za konzerviranje. soje. konoplja. Način izvođenja vježbe Prije postavljanja pokusa potrebno je obaviti dezinfekciju sjemena kako bi se uklonila epifitna mikroflora koja može biti specifična za pojedinu vrstu sjemena. Ako se voda zamuti. fotosinteza i disanje. 1%-tna otopina AgNO3-reagens za kontrolu uspješnosti ispiranja (1 g AgNO3 otopiti u 60-ak mL destilirane vode. ječam. te na kraju utjecati na postotak klijavosti. npr. kako bi provjerili uspješnost ispiranja. kao što su klijanje.1 % otopinu HgCl2. zob 4.3. ječma.5 mL koncentrirane HCl i nadopuni destiliranom vodom do 1000 mL). graha. Ova pojava se javlja između različitih biljnih vrsta “divljih” i “kulturnih” biljaka. kukuruz. rotkvica 6. grah 3. U destiliranu vodu kojom je sjeme isprano dodaje se nekoliko kapi 1 % otopine AgNO3. a također postoji i u odnosu prema mikroorganizmima. kukuruz. klima komora biljni materijal: sjeme: kukuruza. grahorica. suncokret.6. UTVRĐIVANJE ALELOPATSKIH ODNOSA U KLIJANJU Uvod u vježbu Alelopatiju predstavljaju međusobni odnosi između biljnih vrsta koji se uspostavljaju putem specifičnih kemijskih supstanci koje biljke sintetiziraju i izlučuju u okolinu.1%-tni HgCl2 . soja 2. Materijal pribor i oprema: Petrijeve zdjelice. ljulj. Djelovanje sintetiziranih kemijskih supstanci se odražava na karakter i intenzitet fiziološkobiokemijskih procesa u biljkama. gorušica. 61 . dodati 1-2 kapi dušične kiseline i nadopuniti vodom do 100 mL). a može se javiti u svim fazama razvoja biljnog organizma. Nakon dezinfekcije sjeme se ispire destiliranom vodom. minerqalna ishrana. Sjeme se na klijanje postavlja u Petrijeve zdjelice istih dimenzija ili u filter papir. potrebno je ponoviti ispiranje sve dok voda nakon dodavanja AgNO3 ne ostane bistra. Dezinfekcija se vrši potapanjem sjemna 3-5 minuta u 0. pšenica.otopina za ispiranje sjemena (1 g HgCl2 otopa se u 2.: 1. ali sličnih dimenzija sjemena. zobi. pšenica. raži reagensi: 0. što ne bi bio realan pokazatelj alelopatskih odnosa između biljaka. suncokreta. raž 5. suncokret. rast. ječam.

25 sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 2 (pšenica i ječam) 5. 25 sjemenki biljne vrste broj 2 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (ječam i zob) 7. te se utvrđuju alelopatski odnosi preko razlika u masi svježe ili suhe tvari razvijenih biljaka. 50 sjemenki biljne vrste broj 1 (npr. zob) 4. papir je potrebno navlažiti i smotati u "rolu" te također postaviti na 25°C u klima komoru. Rezultati Radi utvrđivanja alelopatije pri klijanju postavljen je pokus sa sjemenjem pšenice. 50 sjemenki biljne vrste broj 2 (npr. 50 sjemenki biljne vrste broj 3 (npr. 25 sjemenki biljne vrste broj 1 i 25 sjemenki biljne vrste broj 3 (pšenica i zob) 6. ječam i zob) Sjemenke se prekriju drugim filter papirom koji se također navlaži destiliranom vodom. pšenica) 2. ječam) 3.3 40/50 4 14/25 5 20/25 6 7 6/17 razlika ukupno 35/50 10/25 15/25 0/17 razlika U tablicu je potrebno upisati postotke klijavosti. po 17 sjemenki svake od tri ispitivane biljne vrste (pšenica. Postotak klijanja sjemenki evidentira se svaki dan nakon početka klijanja . te razlike u postotku klijavosti između sjemena pojedinih biljnih vrsta. Biljke se mogu uzgajati u istim kombinacijama 15 dana. te se alelopatski odnosi utvrđuju kao razlika u postotku klijanja sjemena u jednovrsnim. dvojnim i trojnim uzorcima.Na Petrijeve zdjelice postavi se filter papir i navlaži destiliranom vodom te se na papir ravnomjerno rasporedi 50 sjemenki po slijedećoj shemi: 1. ječma i zobi. zdjelice se prekriju zaštitnom foliju i postave na 25°C u klima komoru. 62 .2. do sedmog dana klijanja. Nakon 7 dana broj proklijalih sjemenki bio je slijedeći: pšenica ječam % razlika ukupno % 10/50 3/25 1/25 3/17 zob % posuda ukupno 1. Ako se sjemenke postavljaju na filter papir veličine A3 formata.

5 odmjernih tikvica od 50 mL. odnosno koncentraciju otopljenih tvari u odnosu na stanice biljnog tkiva su hipotonične i u njima dolazi do povećanja koncentracije otopljenih tvari uslijed prelaska vode u ispitivano tkivo koje povećava svoj volumen. ODREĐIVANJE DEFICITA DIFUZNOG PRITISKA (DDP) Uvod u vježbu Određivanje sile usvajanja vode (DDP) tkiva ili čitavih organa biljke obavlja se pronalaženjem otopine čiji osmotski pritisak odgovara ispitivanom uzorku te u njemu ne dolazi do usvajanja odnosno izdvajanja vode. U otopinama bez biljnog tkiva se odredi refraktometrom refrakcijski indeks ili % suhe tvari. Refraktometar Cilj Odrediti silu usvajanja vode biljnog materijala pomoću refraktometra. FIZIOLOGIJA STRESA KOD BILJAKA 4. Otopina u kojoj nema promjene koncentracije (% suhe tvari) ima osmotsku vrijednost jednaku osmotskoj vrijednosti biljnog tkiva. Praktično mjerenje DDP uz pomoć refraktometra (slika 26) vrši se prema promjeni težine ili volumena biljnog tkiva kao i promjene koncentracije otopine u koju je tkivo potopljeno. nož. Otopine koje imaju manji osmotski potencijal.1. odnosno koncentracija otopljenih tvari jednaka onoj u stanicama biljnog tkiva.4. U jedan niz otopina se potope komadići ispitivanog biljnog tkiva (podjednakog broja i veličine). Izotonične otopine su otopine čiji je osmotski potencijal. otopine saharoze od 0. refraktometar biljni materijal: gomolj krumpira reagensi: destilirana voda. Materijal pribor i oprema: 10 kemijskih epruveta. ravnalo. metalna žlica. sat.2 do 1. stalak za epruvete. Takve otopine nazivaju se hipertonične. te pri tome smanjuju svoju koncentraciju (sadržaj suhe tvari im se smanjuje) a volumen tkiva se smanjuje. milimetarski papir. Otopine s većom početnom koncentracijom zbog svog većeg osmotskog potencijala “izvlače” vodu iz stanica tkiva (plazmoliza). U slučaju da se ta vrijednost nalazi između dvije 63 . pipeta od 10 mL. vaga. Nakon 30 minuta utvrđuje se koncentracija otopina saharoze u kojima je bilo biljno tkivo.0 mol/dm3 i prenese po 10 mL u dva niza epruveta. Slika 26.2 do 1 mol/dm3 Način izvođenja vježbe Priredi se niz otopina saharoze od 0.

8 1. npr.0 % ST 30 min.8 12. Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju izotonične otopine (0. tražena koncentracija se izračuna interpolacijom uz pomoć kalibracijskog dijagrama.koncentracija izotonične otopine saharoze i . koncentracija saharoze [mol/dm3] 0. konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP: br.314 kPa dm3K-1mol-1 . a desno od sjecišta su otopine s višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu. za elektrolite > 1. 64 . 4. a podaci za otopine s biljnim tkivom daju pravac broj 2. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine (očitanje refraktometrom) 6.0 17.2 0.0 1.3 12. Na apscisu koordinatnog sustava se nanosi koncentracija saharoze (0. % ST u otopinama bez biljnog tkiva (očitanje refraktometrom) 6.3 30.molarne koncentracije saharoze.4 24.314 JK-1mol-1) T [K]. primjer rezultata analize.izotonični koeficijent Van’t Hoffa (za neelektrolite = 1. za NaCl i KCl = 1.4 0.3 22. 8.opća plinska konstanta (8.2-1. 2.285 mol/dm3). 3. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi pravac).6 0.0 M) a na ordinatu % suhe tvari otopine. Unošenjem podataka za otopine bez biljnog tkiva i povezivanjem dobivenih točaka dobije se pravac broj 1. DDP se računa prema izrazu: DDP= −R×T ×i ×c R [kPa dm3K-1mol-1] . Iz sjecišta ovih pravaca se spuštanjem okomice na apscisu očitava koncentracija (c) izotonične otopine saharoze.5) 1.2 mol/dm3) su hipotonične i u njima je došlo do povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu.4 26.9 Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni pravac) i pravac % ST 30 min.6 18. 5. Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama saharoze (lijevo od sjecišta: samo otopina 0.apsolutna temperatura (K = 273 + °C) c [mol dm -3] .

35 hipotonična otopina 30 25 % ST 20 15 10 5 0 0.3 30.4 0.0 izotonična otopina hipertonične otopine (c) otopina saharoze nakon 3/4 h Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18°C): DDP = .6 12. a desno od sjecišta su otopine s višom početnom nego konačnom koncentracijom (hipertonične otopine) i u njima je došlo do pada koncentracije nakon potapanja biljnog tkiva zbog izlaska vode iz tkiva u okolnu otopinu.2 0.8 1.8 1. Sve otopine saharoze s nižim početnim koncentracijama saharoze (lijevo od sjecišta: otopine 0.5 kPa 2. 2. 3. 4.314 [kPa dm3 K-1mol-1]× 291[K] × 1 × 0.4 24. Spuštanje okomice na X os iz sjecišta navedenih pravaca daje koncentraciju izotonične otopine (0.2 i 0. konstrukcije dijagrama i izračunavanja DDP: br.3 12.285 [mol dm-3]= .2 0. primjer rezultata analize.6 0.285 0.6 0. nakon uranjanja biljnog tkiva u seriju otopina saharoze (plavi pravac). 5.0 23. 65 .2 28.8 18.0 % ST 30 min. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine (očitanje refraktometrom) 7.8.47 mol/dm3).4 0.0 1.6 18. koncentracija saharoze [mol/dm3] 0.4 mol/dm3) su hipotonične i u njima je došlo do povećanja koncentracije nakon potapanja tkiva u otopinu.689. % ST u otopinama bez biljnog tkiva (očitanje refraktometrom) 6.4 Na grafikonu je prikazan pravac % ST u seriji otopina saharoze bez biljnog tkiva (crveni pravac) i pravac % ST 30 min.

2 0.8 1.314 [kPa dm3 K-1mol-1] × 291[K] × 1 × 0.6 0.0 (c) otopina saharoze nakon 1/2 h Izračunavanje DDP za tkivo gomolja krumpira (temperatura pri analizi je bila 18°C): DDP = .30 25 % ST 20 15 10 5 0 0.1 kPa 66 .4 hipotonične otopine izotonična otopina 35 hipertonične otopine 0.47 0.1137.8.47 [mol dm-3] = .

2 0.6 0.0 % ST u otopinama bez biljnog tkiva % ST 30 min. nakon potapanja biljnog tkiva u otopine 67 . 5.Rezultati br. 4.4 0. 3. koncentracija saharoze [mol/dm3] 0.8 1. 1. 2.

List se izloži djelovanju različitih temperaturnih tretmana (15. Evapotranspiracija se izrazi kao postotna razlika u masi lista. ali i evaporacijom s površine. nakon prolaska kroz kutikulu. koja predstavlja gubitak vode evapotranspiracijom. Ovisno o kemijskom sastavu kutikule. klima komora biljni materijal: list neke zeljaste bijke (salata. slika 27. Vaganje lista g g 68 . kupus). 2 h). u mraku: Konačna masa lista nakon 2 h: g Intenzitet evapotranspiracije: % Početna masa lista na 25oC. biljne vrste se značajno razlikuju po intenzitetu gubitka vode evaporacijom (kutikularna transpiracija). kao i utjecaju svijetlosti. list bršljana Način izvođenja vježbe Vaganjem se utvrdi svježa masa lista. ponovnim vaganjem utvrdi se razlika u masi lista. Materijal pribor i oprema: laboratorijska vaga. odnosno mraka. 25. Rezultati List zeljaste biljke Početna masa lista na 15oC. na svjetlu: Konačna masa lista: g Intenzitet evapotranspiracije: % g Slika 27. Nakon određenog perioda (npr. Cilj Utvrditi prosječni gubitak vode iz lista zeljastih biljaka u određenom vremenskom periodu.2. u mraku: Konačna masa lista nakon 2 h: g Intenzitet evapotranspiracije: % g Početna masa lista na 25oC. na svjetlu: Konačna masa lista: g Intenzitet evapotranspiracije: % List bršljana Početna masa lista na 15oC. ODREĐIVANJE EVAPOTRANSPIRACIJE LISTA Uvod u vježbu Gubitak vode iz zeljastih biljnih dijelova značajno ovisi o temperaturi sredine i uvjetima osvjetljenosti.4. 30oC). Voda u obliku vodene pare izlazi iz lista najvećim dijelom kroz puči (stomatalna transpiracija).

Zbog čega se javlja razlika u intenzitetu evapotranspiracije lista zeljaste biljke i bršljana? 69 .

slika 28). Prikaz nastanka kompleksa Ruhenan’s purple koji daje specifično crvenkasto obojenje.wikimedia. 2.png ) Akumulira se u citoplazmi gdje u stresnim uvjetima može činiti i više od 80% slobodnih aminokiselina. ODREĐIVANJE SADRŽAJA PROLINA Uvod u vježbu Jedna od najčešćih reakcija živih organizama na vodni deficit je stvaranje i akumulacija osmotski aktivnih neutralnih organskih spojeva kao što su šećeri i neke aminokiseline (prolin.5 g biljnog tkiva reagensi: sulfosalicilna kiselina. koji s amino i imino grupama aminokiselina daje crvenkasto obojenje čiji intenzitet ovisi o koncentraciji prolina se mjeri spektrofotometrijski na 520 nm nakon odvajanja prolin-ninhidrin kompleksa (Ruheman's purple) toluenom. špatula. toluen. http://commons. Strukturna formula prolina vrste stresa. Povećanje koncentracije osmolita omogućuje da se iz vanjske sredine usvoji dodatna količina vode a osim toga kompatibilni osmoliti stabiliziraju strukturu proteina. kvarcni pijesak.org/wiki/F ile:(S)-Prolin.3. s koncentracijom i do 200 mM. ninhidrin reagens.4. ninhidrin aminokiselina Ruheman's purple Slika 29. posuda za inkubaciju na kupelji ili sušionik za suhu inkubaciju biljni materijal: 0. tučak. filter-papir Whatman br. Materijal pribor i oprema: tarionik. staklene epruvete. spajanjem ninhidrina i aminokiselina 70 . plastične epruvete sa čepovima. osnovni standard prolina Način izvođenja vježbe Ekstrakcija prolina iz stanica vrši se pomoću sulfosalicilne kiseline. lijevci. slika 29. slijedi reakcija s ninhidrinom. Prolin štiti membrane i proteine od (preuzeto s štetnog djelovanja visokih koncentracija anorganskih iona i temperaturnih ekstrema. Cilj Odrediti sadržaj aminokiseline prolin u biljnom materijalu. stoga ovakvi spojevi imaju važnu ulogu u adaptaciji citoplazme na različite Slika 28. Otpornost genotipova prema stresnim uvjetima može se ocijeniti prema sposobnosti akumulacije slobodnog prolina. čime značajno doprinosi osmotskoj regulaciji citoplazme.

automatskom pipetom se pipetira toluenski sloj s ekstrahiranim prolinom u kivetu za spektrofotometar. Otpipetira se 2 mL filtrata u plastičnu epruvetu i doda 2 mL ninhidrin reagensa i 2mL ledene octene kiseline. Mjeri se transmisija na 520 nm uz podešavanje 0 čistim toluenom a 100% transmisije s a standardom 0. Inkubacija se vrši na 1000C 1 h. dodavanjem ninhidrina i octene kiseline. uz vorteksiranje 15-20 s.6 8 0. od toga 2 mL uzeto za određivanje) Rezultati 71 .0 mL razr. Standardi se rade paralelno sa uzorcima.0 mL dest.8 1. osn.razrjeđenje pri ekstrakciji (1 g uzorka u 10 mL sulfosalicilne kiseline. te se nakon inkubacije reakcija prekida prenošenjem epruveta na led. prolina s kalibracijskog dijagrama (conc.5 g biljnog materijala se homogenizira s 10 mL sulfosalicilne kiseline uz dodatak kvarcnog pijeska (na vrh noža) i profiltrira kroz filter papir Whatman br 2 u staklenu epruvetu.6 1.conc.8 4 0.2 16 1. vode 20 µg prolina /2 mL Formula za preračuna sadržaja prolina na svježu tvar biljke: Sadržaj prolina ( µg/gS SvT) = 5* X odvaga uzorka u g X [µg prolina/2 mL] .0 2.4 12 0.0 konc: 0 0. Nakon što se epruvete zagriju na sobnu temperaturu i odvoji toluenski sloj. standarda + 1. standarda µg prolina/2 mL) 5 .0.u 6 epruveta otpipetira se: 0. Radni standardi: .2 1.4 1. Ekstrahirati prolin dodavanjem po 4 mL toluena.

Cilj Odrediti koncentraciju C vitamina (askorbinske kiseline) u biljnom materijalu Materijal pribor i oprema: digitalni titrator. Također sudjeluje u zaštiti stanica od oksidacijskog stresa uzrokovanog prisustvom slobodnih kisiskovih radikala. metafosforna kiselina Način izvođenja vježbe Reagens DCIP (2. filter-papir. stoga se ekstrakcija AK iz tkiva vrši pomoću metafosforne kiseline. ODREĐIVANJE SADRŽAJA VITAMINA C Uvod u vježbu Askorbinska kiselina (C vitamin) se nalazi u različitim tkivima biljaka.6-diklorofenol-indofenol). Strukturne formule askorbinske kiseline (lijevo) i dehidroaskorbinske kiseline (desno) 72 . Količina utrošenog DCIP preračunava se na mg AK/100 g uzorka. Slika 30. a otopina ostaje bezbojna sve dok se ne potroši sva količina AK u uzorku. lijevci. Daljnjim dodavanjem DCIP otopina ostaje ružičasta što označava kraj titracije. koja inaktivira prisutnu oksidazu u stanicama. Prema tome. 1 g tkiva izmacerirati s metafosfornom kiselinom. profiltrirati i 5 mL ekstrakta titrirati s DCIP. slika 30).4. 1 mL otopine askorbinske kiseline (AK) titrira se sa DCIP (diklorofenolindofenol). Kada se pri titraciji AK ekstrahirane iz biljnog tkiva metafosfornom kiselinom dodaje DCIP. Pri titraciji ružičasta boja treba ostati 15 s. U prisustvu enzima oksidaze askorbinske kiseline dolazi do oksidacije AK u DHAK (dehidroaskorbinsku kiselinu).4.6-diklorofenol-indofenol) ima plavu boju u alkalnoj a ružičastu u kiseloj sredini. AK (askorbinska kiselina). tučak. AK se prevodi u DHAK (slika 30). Predstavlja značajan reducens I poznato je da štiti klorofile od oksidativne fotodestrukcije kisikom koji se oslobađa fotolizom vode. Erlenmeyer tikvica 200 mL biljni materijal: plod paprike reagensi: DCIP (2. tarionik. AK ga reducira u bezbojni oblik pri čemu se sama oksidira do DHAK (dehidroaskorbinska kiselina.

faktor DCIP = 4mgAK mL DCIP Izračun sadržaja vitamina C se dobije prema sljedećoj jednadžbi: Sadržaj C vit (mg AK/100 g uzorka) = mg AK u alikvotu x Faktor DCIP x 2 x 100 Rezultati 73 .

0 M otopinom saharoze i zatvore čepovima. Materijal pribor i oprema: skalpel. smjesa za hlađenje (led u koji se dodaje 33g NaCl na 100 g leda ili 59 g NaNO3 na 100 g leda) Način izvođenja vježbe Pripremi se 100 mL 1 M i 0. a mogu se pojaviti i mehanička oštećenja membrana kristalićima leda. epruvete. tikvice od 100 mL.4. epruvete se stave u posudu s vodom gdje se otapa zaleđeni sadržaj epruveta. Međutim. odnosno 0. Cilj Dokazati da šećeri štite stanicu od pucanja membrana biljnog tkiva izloženog djelovanju niskih temperatura. narušavanje staničnih fizioloških procesa.5 M ili 1.5 M i 1 M otopina saharoze. gumeni čepovi. Bitno je da sloj odrezanih stanica bude što tanji. ZAŠTITNO DJELOVANJE ŠEĆERA PRI NISKIM TEMPERATURAMA Uvod u vježbu Na temperaturama ispod 0°C životna aktivnost je jako umanjena te prestaje na oko -10°C. narušavanje proteinsko pigmentskih struktura. često zbog navedenih posljedica smrzavanja odumire ili se narušavanje fiziološko-biokemijskih procesa odražava na kasnije etape rasta i razvoja.5 M otopine saharoze. neke biljke bez većih posljedica na kasniji rast i razvoj mogu prezimiti i puno niže temperature zraka. Nakon 20-ak minuta zamrzavanja. Građa protoplazme narušava se djelovanjem niskih temperatura te iz staničnog soka obojenih biljnih tkiva izlaze pigmenti. koji specifično bojaju otopinu u koju je biljno tkivo potopljeno. 74 . Dugotrajno djelovanje niskih temperatura. Priređeni preparati stave se u tri epruvete napunjene s 8 mL destilirane vode.5. pinceta biljni materijal: list crvenog kupusa ili lisna drška cikle reagensi: 0. (oko 25 mm2). Skalpelom ili žiletom se odreže površinski sloj stanica lista crvenog kupusa ili lisne drške cikle. ili naglo spuštanje temperatura ispod 0°C imaju za posljedicu narušavanje vodnog režima biljke. Sadržaj otopine u epruvetama zamrzava se pomoću smjese za hlađenje na temperaturi oko -20°C. Biljni organizam koji nepripremljen ulazi u hladan period tokom rasta. Preparati se vade iz otopine (ili se otopina filtrira kroz filter papir) i promatraju morfološke promjene stanica i promjene u boji tkiva i otopine.

Rezultati i zaključak Detaljno opiši morfološke i fiziološke promjene koje su se dogodile na ispitivanim uzorcima uslijed izloženosti niskim temperaturama tj. Potrebno je zaključiti preko kojih se staničnih fizioloških procesa. smrzavanju. a koji se odnose na usvajanje i otpuštanje vode. manifestira zaštitna uloga šećer 75 .

Pri katalaznoj aktivnosti enzim katalizira razgradnju vodikova peroksid na vodu i kisik: 2H2O2 → 2H2O + O2 dok pri peroksidaznoj aktivnosti enzim katalizira oksidaciju supstrata (metanol. nitrit ili elementarna živa) pri čemu nastaje voda: supstrat + 2H2O2 → oksidirani supstrat + 2H2O Velika važnost brze katalize vodikova peroksida potrebna je stoga jer je on snažan i jako reaktivan oksidans koji može oštetiti biološke molekule i time uzrokovati metaboličke poremećaje. AKTIVNOST ENZIMA KATALAZE Uvod u vježbu Katalaza (EC 1. PSII.6. Unutar stanice katalaze ima dosta u peroksisomima i katalitički je vrlo aktivna.1. fotosustav II. superoksid dismutaza. CLK. PSI. fotosustav I. Ovaj enzim pokazuje dvojnu katalitičku aktivnost. ( Preuzeto iz I. životinjama i aerobnim mikroorganizmima gdje katalizira brzu razgradnju vodikova peroksida. Biljne su katalaze tetramerni enzimi. Glavni izvori vodikova peroksida tijekom fotosinteze u C3 biljkama. etanol. H2O2:H2O2 oksidoreduktaza) je enzim pronađen u biljkama. Slika 31. formaldehid.11. Ślesak et al.ref) 76 . ciklus limunske kiseline. katalaznu i peroksidaznu.4. molekulske mase od 54 do 59 kDa te sadrže hem kao prostetičku skupinu. a javlja se i kao produkt djelovanja oksidaza kao što su primjerice glukoza oksidaza. SOD. Vodikov peroksid nastaje kao produkt u mnogim reakcijama procesa fotosinteze i staničnog disanja (slika 31).6. NADPH oksidaza i razne aminokiselinske oksidaze.

laboratorijska čaša od 500mL. Preko utroška otopine kalijeva permanganata za titraciju slijepe probe i probe. ribež. kuhinjski nož.05M fosfatnom puferu (pH = 7. Nakon prekida inkubacije vodikov peroksid koji nije izreagirao titrira se sa standardnom otopinom kalijeva permanganata (1).05M otopina fosfatnog pufera (pH = 7. 0. a koristeći formulu (3) dobiva se aktivnost katalaze izražena kao količina razgrađenog vodikova peroksida po jedinici vremena i volumena enzimskog ekstrakta. Ispitati kako vrijeme inkubacije utječe na aktivnost enzima.Određivanja aktivnosti katalaze Aktivnost katalaze određuje se u inkubacijskoj smjesi sastavljenoj od pufera. pipete od 1. 5H2O2 + 2KMnO4 + 4H2SO4 → 2MnSO4 + 2KHSO4 + 5O2 + 8H2O (1) (2) (3) (VS-VP) x 50 [µmol] (VS-VP) x 50 / t x 10 [µmol min-1 mL-1] VP [mL] . centrifuga biljni materijal: gomolj krumpira reagensi: 0.volumen utrošenog KMnO4 za titraciju probe (P) VS [mL] .5 %-tna otopina H2O2 u 0. ekstrakt katalaze iz biljnog tkiva (gomolj krumpira). 5 %-tna otopina H2SO4. koristeći formulu (2) dobiva se količina vodikova peroksida koji je tijekom inkubacije razgrađen katalazom. 0. Inkubacija se vrši pri sobnoj temperaturi u vremenu do 30 minuta nakon čega se reakcija prekida. Prirediti enzimski ekstrakt i inkubacijske smjese te izračunati aktivnost katalaze. Uz svaki uzorak-probu radi se slijepa proba koja sadrži pufer i enzimski ekstrakt koji je prethodno zagrijan do ključanja.volumen enzimskog ekstrakta u mililitrima 50 – µmoli vodikova peroksida ekvivalentni s 1 mL 0. sat.0). gaza. 5 i 10 mL. Materijal pribor i oprema: 8 Erlenmeyerovih tikvica.02 M KMnO4 Cilj Upoznati se s metodom određivanja aktivnosti katalaze. supstrata i enzimskog ekstrakta.vrijeme inkubacije u minutama 10 [mL] . filter-papir.0) 77 .02 M otopina KMnO4.volumen utrošenog KMnO4 za titraciju slijepe probe (S) t [min] .

Utječe li vremenski tijek reakcije na aktivnost katalaze? Objasnite. sadržaj procijediti preko gaze i profiltrirati kroz filter papir ili centrifugirati pri 5000 G. Dobiveni filtrat (sirovi enzimski ekstrakt) koristiti za određivanje aktivnost katalaze. 2. Dobiveni sadržaj potom titrirati otopinom KMnO4 do nastanka svijetlo ljubičaste boje titrirane otopine. Nakon ekstrakcije. Za potrebe slijepe probe 50 mL enzimskog ekstrakta zagrijati do ključanja i ohladiti na sobnu temperaturu prije upotrebe. Prikaz redosljeda dodavanja i količine reagensa u uzorak Uzorak Reagensi (mL) S1 10 10 5 (5) P1 10 10 5 S2 10 10 5 (10) P2 10 10 5 S3 10 10 5 (15) P3 10 10 5 S4 10 10 5 (30) P4 10 10 5 0. Ovako pripremljen homogenat ostaviti u hladnjaku 30 minuta. 78 . 2. Problemski zadaci: 1.5 %-tna otopina H2O2 Inkubacija 22oC (min) Nakon proteklog vremena inkubacije. Koja je uloga fosfatnog pufera u inkubacijskoj smjesi ? Gubi li katalaza svoju aktivnost zagrijavanjem ? Kako bi ste dobili aktivnost katalaze izraženu u količini razgrađenog vodikova peroksida po gramu biljnog materijala? 5.Način izvođenja vježbe 1. Tablica 6. a aktivnost katalaze izraziti kao količinu razgrađenog vodikova peroksida po jedinici vremena i volumena enzimskog ekstrakta. Priprema enzimskog ekstrakta Odvagati 100 grama gomolja krumpira. Što je specifična enzimska aktivnost? Možete li je izraziti za katalazu u našem slučaju.05M fosfatni pufer Enzimski ekstrakt Prokuhani enzimski ekstrakt 0. Izračunati količinu razgrađenog vodikova peroksida. 4. Usitnjeni materijal homogenizirati miješanjem uz dodatak 100 mL hladnog fosfatnog pufera. 3. nožem ili pomoću ribeža usitniti ga na manje komade i prenijeti u laboratorijska čašu. u tikvicu s uzorkom odmah dodati 5 mL 5% otopine H2SO4 i promućkati. 10 minuta na 4°C. Određivanje aktivnosti Pripremiti uzorke prema tablici 6.

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->